应用ITS2序列对八角茴香及其混伪品的分子鉴定研究

刘 镛 李斯璐 林 好

1广东医科大学药学院 广东省东莞市 523808 2广东天然药物研究与开发重点实验室 广东省湛江市 524023

3广东医科大学基础医学院 广东省东莞市 523808 4广州中医药大学中药学院 广东省广州市 510006

应用ITS2序列对八角茴香及其混伪品的分子鉴定研究

刘 镛1,2李斯璐3林 好4

1广东医科大学药学院 广东省东莞市 523808 2广东天然药物研究与开发重点实验室 广东省湛江市 524023

3广东医科大学基础医学院 广东省东莞市 523808 4广州中医药大学中药学院 广东省广州市 510006

目的：对中药材八角茴香及其混伪品进行分子鉴定，为控制药材质量和指导临床合理用药提供科学依据。方法：通过从GenBank数据库下载中药材八角茴香与其混伪品的DNA条形码ITS2序列，利用MEGA6.06软件进行种内、种间遗传距离分析并构建系统发育树，应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。结果：八角茴香与其混伪品的ITS2序列间存在明显差异，基于ITS2序列的NJ树及其ITS2二级结构均可以将八角茴香与其混伪品明显区分。结论：ITS2作为DNA条形码序列能够有效的鉴别八角茴香及其易混伪品。

八角茴香；DNA条形码；混伪品；ITS2序列；分子鉴定

八角茴香为双子叶植物药木兰科八角茴香（Illicium Verum）的干燥成熟果实，别名大茴香、广茴香、大料，性辛、温，具有温阳散寒、理气止痛、健胃止咳的功效[1]。近年来，市场上发现有用莽草（Illicium lanceolatum）、大八角（Illicium majus）、平滑叶八角（Illicium leiophyllum）、厚皮香八角（Illicium ternstroemioides）、红茴香（Illicium henryi）、红花八角（Illicium dunnianum）、野八角（Illicium simonsii）、地枫皮果实（Illicium difengpi）等伪品冒充正品八角茴香使用。而八角茴香的鉴定方法主要是从基原、性状、显微、理化等方面进行鉴别[2]，这些传统的鉴定方法对操作人员的专业知识要求较高，存在主观性强、稳定性与重复性较差等方面的不足，不能够快速准确地鉴别八角茴香及其混伪品，难以满足中医药现代化发展的要求。因此，亟需建立一种简单、快速、准确的鉴定中药材八角茴香及其混伪品的方法。

DNA条形码（DNA barcoding）技术是分子鉴定技术的最新进展，它是指用标准的、短的DNA片段作为物种标记而建立的一种新的生物物种鉴定方法，由加拿大动物学家、皇家学会会员Paul Hebert于2003年首先提出[3]。随着分子生物学以及生物信息学的快速发展，应用DNA条形码技术对物种进行鉴定已逐渐成为中药材分类学的研究热点[4]。其中，作为分子系统进化研究中最重要的标记之一，ITS2（internal transcribed spacer 2, ITS2）已被提出作为药用植物鉴定的标准条形码序列。然而，利用ITS2对八角茴香的相关鉴定研究尚未发现有专门报道。本研究利用ITS2序列对八角茴香及其混伪品进行分子鉴定，为八角茴香的快速准确鉴定及其开发利用和安全用药提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

本实验所用材料包括八角茴香及其混伪品莽草、大八角、平滑叶八角、厚皮香八角、红茴香、红花八角、野八角、地枫皮果实共9个品种20份样品，所用的ITS2系列来自Genbank下载，并且经NCBI-Blast比对确认为正确序列。

1.2 数据分析

用MEGA6.06软件基于Kimura twoparameter（K2P）模型分析种内、种间遗传距离，并构建系统邻接树 (Neighbor-Joining tree，NJ Tree)，并利用Bootstrap法[5]（1000次重复）检验各分枝的支持率，对八角茴香及其同科属植物进行鉴定分析。用Schultz等人的研究方法（http//its2. bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/cgibin/index.pl）预测各物种ITS2的二级结构[6]。

2 结果与分析

2.1 八角茴香及其混伪品种内及种间差异分析

利用MEGA6.06软件计算八角茴香及其混伪品种内遗传距离和种间遗传距离，可以得到基于K2P模型的遗传距离（详见表1），计算结果显示八角茴香与其他混伪品的种间最小遗传距离均明显大于八角茴香的种内最大遗传距离，表明K2P遗传距离可以鉴别八角茴香及其混伪品。

表 1：八角茴香种内及其与混伪品种间K2P距离

2.2 八角茴香与其混伪品ITS2序列的二级结构分析

由图1可知，八角茴香及其混伪品的ITS2序列二级结构臂夹角几乎类同，但是臂的长度、茎环大小、茎环数目以及环与环之间的距离均有差异。

2.3 NJ树聚类分析

基于ITS2序列构建的八角茴香及其混伪品的NJ系统发育树（图2）中可以看出，八角茴香独立聚为一枝，与其它易混品可明显区分（支持率均大于50%）。

3 讨论

图1：八角茴香及其混伪品药用植物ITS2序列的二级结构比较

图2：基于ITS2序列构建的八角茴香与其混伪品的NJ树

DNA条形码技术在物种鉴定以及相关领域的应用研究已成为现代生物学最活跃的研究领域和新的热点问题之一，也是未来物种鉴定的发展趋势[7]。陈士林课题组在国内率先提出将DNA条形码技术用于中药材的鉴定，并建立了药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[8]。基于ITS2的DNA条形码技术为中药材的快速准确鉴定提供了诱人的前景，受到越来越多学者的关注[9]。

八角茴香中药材在临床与养生应用十分广泛，但市场上八角茴香的混伪品多而混杂。本研究基于ITS2条形码序列研究八角茴香及其混伪品的种内、种间遗传距离，构建系统发育树以及分析ITS2序列的二级结构图，能够准确区分八角茴香及其混伪品。因此，作为DNA条形码的ITS2序列为准确、简便地鉴定八角茴香及其混伪品提供了新的分子鉴定方法，为控制药材质量稳定和指导临床合理用药及中药材的开发利用提供了科学依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:4-5.

[2]李峰,宋晓玲,刘亚鲁.八角茴香及其混伪品的鉴别[J].山东中医杂志, 2011,30(10):739-740.

[3]Hebert,P D,Cywinska A,Ball S L, et al,Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci,2003,270(1512):313-321.

[4]向婷婷,周志勇,刘朝奇,等.DNA条形码鉴定药用植物的研究进展[J].时珍国医国药,2015,26(01):181-183.

[5]Tamura K,Nei M,Kumar S.Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighborjoining method[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(30):11030-11035.

[6]Schultz J,Muller T,Achtziger M, et al.The internal transcribed spacer 2 database--a web server for(not only)low level phylogenetic analyses[J].Nucleic Acids Res,2006,34(Web Server issue):W704-707.

[7]陈士林,庞晓慧,罗焜,等.生物资源的DNA条形码技术[J].生命科学, 2013,25(05):451-459.

[8]陈士林,宋经元,姚辉,等.药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J].中国天然药物,2009,7(05):322-327.

[9]陈珂蕊,何震宇.DNA条形码技术在中药领域的应用进展[J].中华中医药杂志,2016,31(01):208-210.

刘镛（1982-），男，广东省茂名市人。硕士学位。现为广东医科大学讲师。研究方向为中药分子鉴定和分子药理学。

林好（1992-），男，广东省梅州市人。现为广州中医药大学研究生在读学生。研究方向为中药分子鉴定。

李斯璐（1983-），女，广东省韶关市人。硕士研究生学历。现为广东医科大学讲师。研究方向为基础医学。