狨猴腹泻重要病原菌的分离鉴定与药敏试验研究

张占恒，高珂珂，李小慧，林 静，洪莹莹，金天明，韩文瑜

（1. 吉林大学 动物医学学院，长春 130062；2. 天津医科大学 实验动物科学部，天津300070；3. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

狨猴腹泻重要病原菌的分离鉴定与药敏试验研究

张占恒1,2，高珂珂3，李小慧3，林 静3，洪莹莹3，金天明3，韩文瑜1,通信作者

（1. 吉林大学 动物医学学院，长春 130062；2. 天津医科大学 实验动物科学部，天津300070；3. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384）

狨猴腹泻病是一种常见疾病，临床症状主要表现为腹泻、消瘦、精神不振等。对临床发现的天津市某动物中心腹泻狨猴，采集粪便进行细菌分离培养、显微镜镜检、生化试验并进行16S rRNA片段扩增等，鉴定出导致该猴群腹泻的病原菌主要是大肠杆菌和沙门菌。药敏试验显示大肠杆菌对庆大霉素高度敏感，沙门菌对庆大霉素和氨苄西林高度敏感，为该病的治疗提供了依据。

狨猴；腹泻；病原菌；分离鉴定；药敏试验

狨猴是一种珍贵的小型灵长类动物，主要分布于南美洲地区。狨猴由于体型小，繁殖率高，与人类的疾病应急生理反应很相似，特别是在实验研究过程中用药量小，因此被广泛用于动物学，生殖学，药理学等研究[1-2]。腹泻病作为一种常见疾病，可造成狨猴消瘦，营养不良，繁殖率下降甚至死亡。

本试验采集天津市某动物中心腹泻狨猴的粪便，进行细菌分离培养、显微镜镜检、生化试验等实验室诊断，分离出导致腹泻的重要病原菌—大肠杆菌、沙门菌。对病原菌分离株进行药敏试验，结果显示，大肠杆菌对氯霉素高度敏感，沙门菌对庆大霉素和氨苄西林高度敏感。本试验结果对该动物中心腹泻狨猴的合理用药提供了科学依据，对预防和治疗狨猴腹泻病具有一定的临床指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

采集患病狨猴肛门附近的新鲜粪便，装入无菌离心管中，4 ℃运输，2 h内送回实验室，4 ℃保存，备用。

1.1.2 主要试剂与培养基

革兰氏染液，购自南京建成科技有限公司；微量生化管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；XLD培养基购自青岛海博生物技术有限公司；麦康凯琼脂培养基、LB培养基等均按常规方法制备；基本生化试剂等均由实验室提供。

1.1.3 引物设计与合成

根据已发表的细菌16S rRNA序列设计一对通用引物[3]，引物名称与序列见表1。

表1 PCR引物名称及序列

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化

无菌采取患病狨猴粪便，取适量生理盐水稀释10倍，再依次倍比稀释至10-9，每个梯度分别接种于LB固体培养基，培养16～20 h后，挑取单个菌落分别接种于麦康凯和XLD培养基，培养并观察菌落形态，再挑取单个菌落进行分离培养。观察并记录病原菌菌落的生长状况。

1.2.2 病原菌扩大培养

分别挑取单个菌落，接种于LB液体培养基中，37 ℃摇床培养16～18 h，4 ℃保存，备用。

1.2.3 显微镜观察

用移液枪无菌移取20 μL摇匀的菌液，置于干净的载玻片上并摊匀，自然晾干后，进行革兰氏染色，在油镜下观察记录病原菌的菌体形态特征。

1.2.4 生化试验

选取葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇等生化管，打开生化管后，用接种环每管分别加入分离出的病原菌，倒置生化管于37 ℃ 5％的CO2恒温培养箱36 h，观察记录每个生化管中的现象。

1.2.5 病原菌16S rRNA基因的扩增与测序

以菌液为模板，XJTY-F和XJTY-R为上下游引物，对病原菌16S rRNA基因进行扩增。20 μL反应体系：2×Taq酶预混液10 μL，灭菌去离子水 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶进行电泳，于自动凝胶成像仪上观测结果。剩余PCR产物-20 ℃保存备用。

PCR产物由上海生工生物股份有限公司测序，测序结果在GenBank数据库中进行Blast分析。

1.2.6 药敏试验

取生理盐水，调液体培养的菌液浓度至0.5麦氏单位，含菌量在1×108～2×108CFU/mL。取灭菌的棉签拭子浸入纯化好的菌悬液中，将多余的菌液在管壁挤出，涂布在培养基上，旋转平皿60°，重复涂3次。室温静置3～5 min，无菌条件下将药敏片放在固体培养基上，每个培养基上均匀放置6个药敏片，于37 ℃ 5％的CO2恒温培养箱中培养48 h，测量抑菌圈的直径，并根据判断标准[4]判定该细菌对各抗生素药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 临床症状

患病狨猴腹泻，粪便呈黄色黏液状、脱毛、精神沉郁、反应迟钝、食欲下降、机体消瘦，个别呈现呕吐、发热等症状。

2.2 菌落特征和形态

分离出的病原菌Ⅰ在麦康凯培养基上呈现光滑、圆形、桃红色的菌落（图1），油镜下可见细菌呈两端钝圆的短小杆状，不呈长链状排列，无芽孢，革兰氏阴性菌（图2），在LB上菌落黄色（图3），有白色絮状沉淀。

图1 病原菌Ⅰ在麦康凯培养基上的菌落形态

图2 油镜下病原菌Ⅰ的革兰染色形态

图3 病原菌Ⅰ在LB培养基上的菌落形态

病原菌Ⅱ使XLD培养基变红，菌落中央黑心（图4），油镜下可见细菌呈两端钝圆的杆状，革兰氏阴性菌（图5）。

图4 病原菌Ⅱ在XLD培养基上的菌落形态

图5 在油镜下病原菌Ⅱ的革兰染色形态

2.3 生化试验结果

将分离出的病原菌Ⅰ接种到生化管，37 ℃培养36 h，均可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、赖氨酸、鸟氨酸、靛基质，不发酵硫化氢、尿素（表1-1），其他生化特性与大肠杆菌的特征相符合，初步确定为大肠杆菌。

将分离出的病原菌Ⅱ接种到生化管，37 ℃培养36 h，均可发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、赖氨酸、硫化氢，不发酵乳糖、蔗糖、鸟氨酸、靛基质、尿素（表1-2），其他生化特性与沙门菌的特征相符合，初步确认为沙门菌。

表1-1 病原菌Ⅰ的生化试验结果

表1-2 病原菌Ⅱ的生化试验结果

2.4 分离菌株16S rRNA基因扩增结果

以提取的分离菌株基因组为模板，XJTY-F、XJTY-R为引物进行PCR扩增，结果扩增出约1 500 bp的特异性片段（图6）。将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果与GenBank中已发表的大肠杆菌基因序列和沙门菌序列进行比对，同源性高达99.0％和99.5％。证明分离菌分别为大肠杆菌和沙门菌。

图6 分离菌株16S rRNA基因PCR扩增结果（注：1～5：分离菌16S rRNA基因的扩增产物；M：DM 2000）

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离株大肠杆菌对庆大霉素高度敏感，对环丙沙星和大观霉素中度敏感；对卡那霉素、四环素和红霉素不敏感；对氨苄霉素、氧氟沙星、氟哌酸和新霉素耐药（如表2-1）。分离株沙门菌对庆大霉素和氨苄西林高度敏感；对卡那霉素、大观霉素和环丙沙星中度敏感；对链霉素、四环素、氧氟沙星和红霉素不敏感；对氟哌酸和新霉素耐药（表2-2）。

表2-1 大肠杆菌的药敏试验结果

表2-2 沙门菌的药敏试验结果

3 结论与讨论

狨猴作为一种实验动物，其健康状况关系到试验结果的可靠性，而腹泻病是狨猴的常见疾病，发病后应引起高度重视，及时找出传染源和致病原因，并加强治疗。感染细菌、真菌、病毒、寄生虫以及应激、环境因素的改变都可能引起狨猴的腹泻，细菌感染是其中常见的病因之一，既可能是感染单一细菌，也有可能是多种细菌混合感染。目前，沙门菌和大肠杆菌感染猴导致腹泻比较普遍[5]，志贺氏菌感染也常见报道[6]。本试验采集天津市某动物中心腹泻狨猴的粪便，进行细菌分离培养、显微镜镜检、生化试验等实验室诊断，分离出导致猴群本次腹泻的病原菌主要是大肠杆菌和沙门菌。

本试验应用聚合酶链反应（PCR）法检测细菌，具有准确和特异的优点。生物细胞DNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列，保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础[7]，所以可根据rDNA（核糖体DNA）序列设计用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物检测或鉴定的探针。目前，以16S rRNA为聚合酶链式反应（PCR）扩增靶分子的细菌快速分类鉴定的标准方法已经成功建立[8-9]，该方法可以应用于细菌种、属和科的鉴定及系统进化分析等。

在本试验检测的11种常用药物中，不同的分离菌株对不同的抗生素产生耐药性。这种现象可能是发生细菌病时未开展细菌药敏试验，盲目乱用抗生素导致的。致病菌的耐药性增强的情况复杂，临床用药存在很大困难。致病性大肠杆菌的耐药性现象已普遍存在，而且多为多重耐药[10]，沙门菌和大肠杆菌类似，所以在抗菌药物的选择上要考虑准确的剂量和疗程，采取适当的联合用药、交叉用药、轮换用药的方式。一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用，增加疗效；另一方面可以避免病原菌长期与某一种药物接触，增加产生耐药性机率。同时合理应用维生素、益生素等辅助药物，恢复机体的生理机能，增强自身免疫能力，真正做到合理用药和科学用药，最大限度的降低耐药性的产生。

本试验结果对该动物中心腹泻狨猴的合理用药提供了科学依据，对预防和治疗狨猴腹泻病具有一定的指导意义。

[1] Okano H，Hikishima K，Iriki A，et al. The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications[J].Seminars inFetal and Neonatal Medicine, 2012，17（6）：336-340.

[2] Yasuda M，Inoue T，Takakura A，et al. A case of intestinal mucormycosis in a common marmoset （Callithrix jacchus）[J].Journal of Veterinary Medical Science，2012，74（3）：357-359.

[3] 李玉峰，代娟，刘红露. PCR快速检测肠毒素大肠杆菌方法的研究[J]. 卫生研究，2008，37（2）：231-233.

[4] 中华人民共和国国家质量检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 纸片发抗菌药物敏感试验标准：WS/T125—1999 [S]. 北京：中国标准出版社，1999.

[5] 赵远，杨亮宇，张士跃，等. 腹泻猕猴肠道致病菌感染状况及药物敏感性调查[J]. 云南畜牧兽医，2008（3）：40-41.

[6] 蒋观成，王德莲，宋怀燕，等. 猕猴肠道致病菌的检测[J]. 中国人兽共患病学报，1993（4）：26-28.

[7] 滕懿群. 16S rRNA基因PCR对细菌感染的分子生物学研究[J]. 国外医学（流行病学传染病学分册），1997，24（2）：60-64.

[8] 周永运，戎建荣，白雪梅，等. 16S rRNA基因序列分析用于诊断病原性细菌感染初步研究[J]. 中国人兽共患病学报，2006，22（7）：639-642.

[9] Kommanee J，Akaracharanya A，Tanasupawat S et al. Identification ofAcetobacterstrains isolated in Thailand based on 16S–23S rRNA gene ITS restriction and 16S rRNA gene sequence analyses[J].Annals of Microbiology，2008，58（2）：319-324.

[10] 曲海娜，邹玲，刘文华，等. 毛皮动物细菌病流行病学调查及耐药分析[J]. 中国动物检疫，2009，26（2）：48-50.

Study on Isolation and Identification of Marmoset Diarrhoea Pathogenic Bacteria Strain and Its Sensitivity Tests to Drug

ZHANG Zhan-heng1,2,GAO Ke-ke3, LI Xiao-hui3, LIN Jing3, HONG Ying-ying3, JIN Tian-ming3, HAN Wen-yu1,Corresponding Author
（1. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China; 2. Department of Laboratory Animal, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China.）

Diarrhoea is a kind of marmoset disease which mainly caused diarrhea, weight loss and spirit depressed. In this paper, the stool samples were collected from marmoset in an animal center in Tianjin. Then the samples were used for a series of laboratory diagnosis, such as bacterial isolation and culture, microscopic examination, biochemical tests and PCR detection of 16s rRNA to identified the isolated strains. The results showed that the isolated strains wereEscherichia coliandSalmonella. Drug sensitive test was examined, and the results showed that the isolatedEscherichia colistrain is highly sensitive to gentamicin, the isolatedSalmonellastrain is highly sensitive to gentamicin and ampicillin.

marmoset; diarrhoea; isolation and identification; drugs sensitive test

S852.61

A

1008-5394（2016）04-0005-04

2016-08-10

天津市优秀科研创新团队资助项目“兽医生物技术”（TD12-5019）；天津市优秀科技特派员项目“规模化猪场腹泻病的监测及净化技术研究”（16JCTPJC45000）；天津市农业科技成果转化与推广项目“规模化猪场仔猪腹泻病的监测及防控技术推广”（201601380）

张占恒（1988-），男，天津市人，实验师，硕士，主要从事病原微生物检测与耐药性的研究。E-mail：zhangzhanheng@tmu.edu.cn。

韩文瑜（1955-），男，河北阜城人，教授，博士，主要从事病原微生物检测与耐药性的研究。E-mail：hanwy@jlu.edu.cn。