HAART后血液及精液中HIV水平的比较研究

焦艳梅，刘翠娥，陈威巍，福军亮，孙丽君，吴 昊，王福生

·专题论著·

HAART后血液及精液中HIV水平的比较研究

焦艳梅，刘翠娥，陈威巍，福军亮，孙丽君，吴 昊，王福生

目的高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy, HAART）6个月后，对HIV感染者血浆及精浆中的HIV RNA水平进行比较研究，对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）及精液细胞中的HIV DNA水平进行比较研究。方法收集HAART 6个月后血液中HIV RNA下降到检测不出的16例患者的精液和血液样本，采用实时定量PCR的方法检测其血浆及精浆中的HIV RNA水平，PBMC及精液细胞中的HIV DNA水平。结果16例患者的精浆中有15例可检测到HIV RNA，在PBMC及精液细胞中均可检测到HIV DNA，且二者HIV DNA水平差异无统计学意义。结论HAART 6个月后，大多数患者精液中仍可检测到HIV RNA及HIV DNA。

高效抗逆转录病毒治疗；精液；HIV；病毒载量

性传播HIV的风险与生殖器中的HIV RNA水平密切相关[1-2]。高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy, HAART）可大大降低其传播风险[3-4]，国外的一些研究认为约15％的患者在HAART 6个月后，血液中的HIV已经降低到检测不到的水平，精液中仍可检测到HIV[5-6]。在中国，性传播已成为目前AIDS传播的主要途径，HIV在中国男男同性人群中传播率高于其他国家[7]。且研究发现不同人种感染及感染不同的HIV亚型，精液中HIV量存在差异[8-9]。目前关于HAART后中国HIV感染者精液中HIV的水平及特性报道较少。

精液是精液细胞和精浆的复杂混合物。HIV感染患者精浆中可检测到HIV RNA，而HIV DNA存在于精液细胞中[10]。精液中游离的HIV有可能来自精液中感染的白细胞。HIV DNA主要有三种形式：线性非整合形式、环状非整合形式和整合的形式。环状的HIV DNA可进一步分为1个长末端重复序列（1-long terminal repeats, 1-LTR）和2个长末端重复序列（2-LTR）两种形式。2-LTR HIV DNA的半衰期较短，代表正在复制的病毒。而整合的HIV DNA的半衰期较长，是潜伏HIV的重要组成部分。目前对精液中各种HIV DNA的水平报道也较少。

本研究中，入组了16例有效HAART 6个月后的中国HIV感染者，比较其血液和精液中的HIV RNA和HIV DNA水平。

1 材料与方法

1.1 对象 入组16例接受HAART 6个月的HIV感染者，均为男性。患者的平均年龄为32.8岁，治疗前外周血中CD4+T淋巴细胞平均计数为268个/μl，治疗6个月后外周血中CD4+T淋巴细胞平均计数为418个/μl。其中10例感染的HIV亚型为B亚型，另外6例感染的为C亚型。患者的一般情况见表1。收集患者同一时间点的血液和精液标本，并于4 h内处理。本研究方案经首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会批准，所有受试者均于采血前签署知情同意书。

表1 HIV感染者一般情况Table 1 General data of patients with HIV

1.2 标本的处理 EDTA抗凝血在室温下1200×g离心5 min，吸取血浆，然后Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。精液标本在冰上放置30 min后，800～1000×g离心10 min分离精液细胞和精浆。

1.3 血浆及精浆中的HIV RNA检测 采用德国罗氏公司的Cobas TaqMan HIV-1 HPS试剂，按照试剂盒说明，提取RNA及逆转录后，用实时定量PCR方法进行分析。

1.4 总的、整合型及2-LTR环状HIV DNA定量分析 所用方法参照文献[11]。针对总的HIV DNA定量引物：利用LTR及gag中一对引物，在LTR中设计探针，检测总HIV DNA。针对整合型HIV DNA定量引物：一个引物是针对人类基因组的特异性的序列Alu，另外一个引物是针对HIV LTR特异的序列。针对2-LTR环状HIV DNA定量引物：2-LTR环状病毒DNA中，2个LTR连接点的基因具有特异的序列，针对此特异的序列设计引物。应用Qiagen DNA提取试剂盒提取患者PBMC或精液细胞的DNA，25.0 μl实时定量PCR的反应体系包括2.5 μl的DNA模板，12.5 μl的PCR反应体系混合物，1 μmol的引物及0.2 μmol的探针。实时定量PCR反应条件为：95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5统计学软件进行分析。计量资料分别服从正态分布，2组间比较采用成组t检验（组间方差齐）。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者血浆、精浆中HIV RNA水平 有效HAART 6个月后，16例患者血浆中的病毒载量均降低到检测不到的水平。而其中15例患者在HAART 6个月后，精浆中HIV RNA仍可检测到。见表2。

表2 HIV RNA水平在血浆和精浆中的比较Table 2 Comparision of HIV RNA in blood plasma and seminal plasma

2.2 患者PBMC及精细胞中HIV DNA水平 有效HAART 6个月后，PBMC及精液细胞中均可检测到总的HIV DNA（均数分别为143.17 copies /106个、230.90 copies /106个），整合的HIV DNA（均数分别为71.60 copies/106个、98.03 copies/106个）及2-LTR环状的HIV DNA（均数分别为16.21 copies/106个、7.44 copies/106个）。且PBMC与精液细胞中总的（图1A）、整合的（图1B）及2-LTR环状的（图1C）HIV DNA差异无统计学意义。见图1。

图1 HAART 6个月后总的、整合的及2-LTR环状HIV DNA水平在PBMC及精液细胞中的比较A. PBMC及精液细胞中总的HIV DNA的比较； B. PBMC及精液细胞中整合的HIV DNA的比较；C. PBMC及精液细胞中2-LTR环状HIV DNA的比较Figure 1 Comparision of total, integrated and 2-LTR circular HIV DNA in PBMCs and semen cells

3 讨 论

全球范围内，性传播尤其是男男同性传播已成为HIV传播的最主要的途径。男男同性传播HIV的风险与精液中HIV的水平密切相关。不同人种、不同的HIV亚型及不同用药方案，患者精液中的HIV载量都会存在差异[8-9]。关于中国HIV患者HAART 6个月后，血浆中HIV RNA降低到检测不出时精液中HIV存在情况的报道较少。本研究中，16例患者在HAART 6个月后，血浆中均检测不到HIV RNA的情况下，其中15例患者精浆中均仍可检测到HIV RNA。这一比例远高于国外的报道。国外报道约7％～15％的HIV感染者，在血浆中检测不到病毒载量的情况下，精浆中仍可检测到HIV RNA[5-6,12]。本研究结果与国外报道不一致，可能与患者所应用的药物不同，种族差异及感染的HIV亚型不同等有关。有报道称依非韦仑（efavirenz, EFV）精液穿透性差，导致该药物在精液中的浓度较低，从而使该药物在精液中抗HIV的作用减弱，是精液中HIV载量较高的原因之一[13]。本研究中患者均使用EFV，这可能是入组患者精液中HIV RNA水平较高的原因之一。另外，入组患者与既往报道患者种族不同，感染的HIV亚型也不同，这些也可能是导致精液中HIV量差异的原因。本实验中检测到的精浆中HIV RNA的水平均较高，确切原因须要进一步研究。HAART 6个月后，精液中的HIV RNA仍可检测到，并不能说明HAART对精液中的HIV无效，而是降低的程度相对弱。精液中HIV须要达到一定的水平才能够成功传播HIV，在HAART 6个月后，精液中HIV RNA虽存在但是否能够传播HIV，是否是中国男男同性恋人群HIV传播率较高的原因值得进一步研究。

再者，本研究发现在精液细胞中也可检测到HIV DNA。精液的成分复杂，由睾丸、附睾、前列腺、精囊腺和尿道球腺等分泌物组成。目前已在男性生殖道中检测到感染HIV的T细胞和巨噬细胞，一般认为HIV DNA主要存在这些T细胞及巨噬细胞中。而对于HIV是否感染精子尚存在争议[14-15]。有研究认为精子对HIV感染不敏感。但到目前为止，尚无明确的证据证实这些HIV DNA到底存在于哪些细胞。

总之，我们对HAART 6个月后精液及血液中的HIV RNA及HIV DNA进行对比研究，发现血浆中HIV RNA降低到检测不到的情况下，精浆中仍可检测到HIV RNA。而PBMC及精液细胞中均可检测到HIV DNA，并且HIV DNA的水平差异无统计学意义。其机制须要进一步研究，并要进一步确定HAART 6个月后精液中HIV的水平是否足以导致性伴感染。

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（2016-11-13收稿 2016-12-15修回）

（责任编委 王永怡 本文编辑 闫晶晶）

Comparsion of HIV viral load in blood and semen after HAART

JIAO Yan-mei*, LIU Cui-e, CHEN Wei-wei, FU Jun-liang, SUN Li-jun, WU Hao, WANG Fu-sheng*
Research and Treatment Center of Infectious Diseases, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

ObjectiveAfter highly active antiretroviral therapy (HAART) 6 months, a comparative study of HIV RNA levels in plasma and seminal plasma of HIV patients was made. Also a comparative study of HIV DNA levels in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and seminal plasma of HIV patients was made.MethodsHAART 6 months after HIV in blood RNA decreased to undetectable in 16 patients of semen and blood samples were detected by real-time quantitative PCR in plasma and seminal plasma HIV levels of RNA, PBMC and DNA levels in sperm cell HIV.ResultsHIV RNA was detected in 15 cases of seminal plasma in 16 patients, and HIV DNA was detected in PBMC and sperm cells, and there was no significant difference between the two groups.ConclusionsHIV RNA and HIV DNA could be detected in most of the patients after 6 months of HAART.

HAART; semen; HIV; viral load

R512.91

A

1007-8134(2016)06-0333-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.06.004

国家科技重大专项（2015ZX10004801-002-002）；国家自然科学基金（81471577，81572462）；北京市自然科学基金（152072）；北京市科技计划（D141100000314004）

100039 北京，解放军第三〇二医院感染性疾病诊疗与研究中心（焦艳梅、陈威巍、福军亮、王福生）；100069，首都医科大学附属北京佑安医院感染中心（刘翠娥、孙丽君、吴昊）

王福生，E-mail: fswang302@163.com；焦艳梅，E-mail: jiaoyanmei@sina.com

*Corresponding author. WANG Fu-sheng, E-mail: fswang302@163.com; JIAO Yan-mei, E-mail: jiaoyanmei@sina.com