丝状真菌在纤维素酶合成过程中碳源代谢调控的研究进展

董妙音，王曙阳*，王雨辰，许富强，李文建，陈积红，刘敬，胡伟

（1.中国科学院近代物理研究所，甘肃兰州730000；2.中国科学院大学生命科学学院，北京100049；3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；4.甘肃微生物育种实验室，甘肃武威733001；5.兰州大学基础医学院，甘肃兰州730000）

丝状真菌在纤维素酶合成过程中碳源代谢调控的研究进展

董妙音1,2，王曙阳1,5*，王雨辰1,3，许富强1,2，李文建1,4，陈积红1,4，刘敬1，胡伟1

（1.中国科学院近代物理研究所，甘肃兰州730000；2.中国科学院大学生命科学学院，北京100049；3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；4.甘肃微生物育种实验室，甘肃武威733001；5.兰州大学基础医学院，甘肃兰州730000）

丝状真菌可以分泌大量纤维素酶并能有效地降解纤维素底物。在纤维素酶的合成过程中，碳源对产酶微生物有着不可替代的作用，然而对于微生物碳源响应及代谢调控有关的机理仍不是很清楚，从而制约了纤维素酶产业的发展。因此，本文综述了丝状真菌中转录调控因子对纤维素酶合成过程的影响，探讨了真菌在纤维素酶表达过程中对碳源代谢的调控，包括对碳源的响应、碳源对产酶过程的诱导阻遏，并展望了纤维素酶的研究方向。

丝状真菌；纤维素酶；碳源代谢；调控

纤维素是自然界中存在的最多的一类可再生生物质资源，全世界农作物秸秆年产量超过20亿t，而其中将近20%以烧荒的形式烧掉，这不仅造成了严重的环境问题，对资源也是一种严重的浪费[1-2]。纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化酶，可以使纤维素分解生成葡萄糖的一组酶的总称，在轻工业如造纸、食品、饲料、环保等领域的应用正日益广泛。不仅能够缓解能源危机，而且还可以保护环境，促进全球经济的可持续发展。

分泌纤维素酶的微生物在自然界中分布广泛，一般用于工业化生产的主要为丝状真菌，包括曲霉属（Aspergillus sp.）、木霉属（Ttichodermasp.）、青霉属（Penicillumsp.）等，真菌产纤维素酶的主要特点为酶系全、产量高，并能分泌到细胞外[3]。

碳源的作用对于产酶微生物来说不仅是作为重要的能量供应，还是生物体代谢的底物，其存在种类和数量对产酶过程而言是极其重要的。此外，碳源物质还在微生物的许多生理代谢过程中扮演着调节因子的角色，而且存在着比较复杂的碳源感应系统，在产纤维素酶的丝状真菌中更是如此[4]。由于碳源的不同而诱导产生的纤维素酶的产量和种类之间也存在着很大的差异，许多产酶微生物对不同碳源响应的差异可能是在进化过程中对环境的适应所形成的[5]。

真菌纤维素酶合成的诱导调控是其菌株自身为更好地适应周围环境、高效的获取物质和能量而进行的一系列复杂有序的生理生化过程，其中所涉及的代谢层次和调控途径复杂多样，包括外界碳源信号的感应和传递、纤维素酶基因的转录调控、转录后水平修饰等[6]。为了提高纤维素酶的产量的对纤维素底物的降解活性，国内外科学工作者自20世纪60年代开始做了大量的纤维素酶的研究，对纤维素酶的生化性能、降解机制及转录调控因子鉴定等做了较为深入的系统研究。但是对于纤维素类诱导性碳源是如何诱导微生物合成大量的纤维素酶以及微生物是如何对外界环境中诱导性碳源进行感应的，其机制仍然不清楚。

本文综述了国内外关于丝状真菌在产纤维素酶过程中关于碳源代谢的转录水平上调控因子的调控，探讨了真菌纤维素酶表达过程中碳源代谢调控的研究现状，包括对外界环境中碳源的感应、碳源对产酶过程的诱导阻遏等，以期为纤维素酶生产的进一步深入研究、理性改造工业产酶菌株提供新的参考思路。

1　丝状真菌纤维素酶在表达过程中对转录水平的调控

1.1调控因子对转录水平的调控

在真菌中，纤维素酶基因的转录调控方式复杂多样，特别是在调控因子的作用下高效有序的完成纤维素酶基因的精确表达。

作为真核的产酶微生物，在纤维素降解酶基因中已经发现了几类具有重要作用的调控元件，包括转录激活因子（XlnR、Xyr1、AceII等），碳源代谢抑制因子（AceI、CreA/Cre1等）。而研究较多的是转录激活因子XlnR，最初是在黑曲霉中分离得到的，其DNA结合序列为5'-GGCTAAA-3'，也是丝状真菌中发现的可以同时调控木聚糖酶和纤维素酶基因的转录激活因子[7]。有学者在研究D-木糖对纤维素酶的诱导效应时发现，D-木糖首先引起XlnR的磷酸化[8]，然后进一步调控D-木糖对半纤维素酶的诱导表达。

作为转录激活因子XlnR的同源蛋白Xyr1，在瑞氏木霉中作为纤维素酶和半纤维素酶基因主要的转录调控因子之一，其缺失可以使所有的诱导物对纤维素酶和半纤维素酶的诱导表达丧失活性。Xyr1具有典型的锌指类结构，它与启动子上的靶序列GGC（T/A）3进行结合而行使功能[9]。AceII也是一个锌指类结构的转录激活因子，能够体外结合cbh1启动子的GGCTAATAA序列[10]。Xyr1与AceII具有相同的结合位点，所以可以推测Ace2与Xyr1之间可能存在某种相互作用。CreA是丝状真菌中普遍存在的介导碳源降解物阻遏的含C2H2锌指结构的转录调控因子。CreA/Cre1基因的突变会使菌株丧失葡萄糖阻遏效应，实验证实，在里氏木霉抗葡萄糖阻遏突变株Rut-C30中，Cre1基因基本丢失，只剩一些片段，但是当转入全长Cre1时，葡萄糖对纤维素酶表达的阻遏效应又开始恢复[11]。

在大多数情况下，真菌内存在的这些调控因子一般都不是单独进行调控，而是协同发挥作用，而且在进行调控时，这些调控因子本身都需要进行一些修饰，比如磷酸化、泛素化等而发挥作用。

2　丝状真菌在纤维素酶表达过程中对碳源的代谢调控

丝状真菌纤维素酶的诱导表达受碳源的严格调控，这不仅表现在不同碳源的诱导调控上，即使是同一碳源，对于不同种类的微生物，其调控和对碳源的感应机制也存在着很大区别。

2.1丝状真菌对外界环境中碳源信号的响应

丝状真菌对外界碳源的响应，是碳源代谢调控的第一步，也是基础代谢非常重要的组成部分。合成纤维素降解酶的丝状真菌只有在纤维素基质上生长时，才进行大量的纤维素酶合成并分泌到胞外。但是，这些微生物是如何感知外界纤维素碳源的存在，固体不溶性的纤维素分子是如何进入胞内来诱导纤维素酶基因表达的，其机理目前还有争论。

目前人们普遍接收的观点是由于基础水平表达的纤维素酶对胞外的纤维素类物质进行初步地水解，生成具有诱导活性的寡糖小分子如纤维二糖，然后这些寡糖分子被一类膜转运蛋白转运至胞内从而诱导纤维素酶基因的高效表达，以进一步降解外界环境中的纤维素类底物[12]。这种最初的诱导性寡糖结合转运蛋白Cdt1、Cdt2是在粗糙脉孢菌中分离鉴定得到的。Cdt1和Cdt2都属于主要协助转运蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS），具有典型的12个跨膜螺旋，且这两个蛋白本身也具有较高的一致性[13]。ZNAMEROSKI E A等[14]在研究中对Cdt1和Cdt2进行了点突变，结果发现这种点突变能有效地减弱对纤维二糖的转运活性，但是突变株对胞外纤维二糖的响应以及对纤维的水解活性却没有受太大影响，这说明转运蛋白的转运活性可能与信号传导方式和产酶的水解能力没有明显的相关性。到目前为止，已经从其他菌株中也鉴定得到了这种寡糖转运蛋白，如CdtC、CdtD、CdtG等，而且这些转运蛋白的活性对纤维素酶基因的转录有着重要的作用[15]。ZHANG W X等[16]在里氏木霉中分离得到了一种具有纤维二糖转运活性的转运蛋白Stp1，发现Stp1是一个多功能的糖转运蛋白，并且兼有葡萄糖和木糖转运活性，紧接着对Stp1基因进行敲除，结果发现Stp1的缺失影响了菌株再以纤维二糖为碳源的生长状况，同时也丧失了纤维二糖对纤维素酶的诱导作用。在整个碳源诱导过程中，这些纤维素等诱导物自身或其中间代谢产物代谢产物作为真正的诱导物与载体转运蛋白结合并转运至胞内，然后激活并传递纤维素酶表达信号，最终启动纤维素酶基因的高效表达[17]。

2.2纤维素酶诱导型碳源的调控

纤维素降解酶是一类诱导型酶，所以在纤维素酶合成分泌过程中，存在一定的诱导性碳源对于纤维素酶的高效合成分泌是必需的，同样，这种碳源的存在也是影响纤维素酶产量和其水解效率的主要因素之一，而且不同的诱导性碳源对纤维素酶的诱导表达作用是不同的。当外界环境中存在有纤维素类诱导性碳源时，这种碳源信号就会被产酶微生物所感应，进而使得细胞被这种信号所诱导而启动纤维素酶基因的高效表达。

纤维二糖是纤维素降解最主要的可溶性产物，研究表明其对多种真菌纤维素降解酶基因的表达具有很强的诱导活性[18]。有学者研究表明在里氏木霉（Trichoderma reesei）的培养过程中当有较低浓度的纤维二糖存在时，其可以通过一个载体转运蛋白被转运进胞内诱导纤维素酶基因的表达，而且该载体转运蛋白对纤维二糖的转运活力要高于胞外β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的降解活性[19]。这说明只有在低浓度的纤维二糖存在时，才能对纤维素酶基因的表达起诱导作用，因为浓度较高时，还受到胞外β-葡萄糖苷酶活性的影响。所以，纤维二糖对纤维素酶基因表达的调控作用取决于纤维二糖的转运活性与水解速度的之间的平衡[20]。

此外，槐糖也是一种很重要的诱导碳源，可诱导里氏木霉纤维素酶基因的大量表达。槐糖被认为是将纤维素水解产物经过一些内切葡聚糖酶经过转糖基作用而形成的产物[21-22]。但是，有研究发现，槐糖的这种碳源诱导效应对产酶菌株具有一定的特异性，如在黑曲霉（Aspergillus niger）中槐糖中并不能起诱导作用[23]，可能是由于黑曲霉（A.niger）较高的β-葡萄糖苷酶水解活性。但是在粗糙脉孢菌（N.crassa）即使将主要的β-葡萄糖苷酶基因进行敲除，槐糖仍然不能诱导纤维素酶基因的表达[24]。

在纤维素酶的诱导表达过程中，有些非纤维素来源的碳源也可以很好的诱导纤维素酶的高效表达，如乳糖。FANG X等[25]以乳糖作为诱导碳源进行产酶研究时，发现加入1%的乳糖后，纤维素酶表达能力大大提升。当微生物生长比较缓慢时，在培养基中添加半乳糖也可以诱导纤维素酶基因的表达[26]，添加乳糖对纤维素酶的诱导机制已经经历了很长一段时间的研究，包括乳糖的代谢途径、胞内乳糖的代谢组分析等，虽然发现了几个可能与纤维素酶诱导相关的寡聚糖，但是仍然没有清楚的揭示乳糖对纤维素酶的诱导机制[27]。

2.3纤维素酶碳源代谢阻遏的调控

每一种纤维素酶的合成分泌受其作用的碳源代谢终产物的调控，当碳源代谢的终产物累积达到一定的阈值时，细胞将会停止纤维素酶的继续合成，而这种在纤维素酶合成过程中的碳源代谢终产物主要是葡萄糖[28]。葡萄糖作为公认的在纤维素酶基因表达过程中抑制性的碳源，细胞优先利用葡萄糖代谢产生的能量用于菌株的生长繁殖而非用于纤维素酶诱导产生途径。ILMEN M等[29]研究发现当产酶微生物生长在非诱导性碳源的培养基上时，利用印记杂交（Northern blotting）杂交里氏木霉（T.reesei）的RNA，但是并没有检测出cbh1的信号存在，但是当葡萄糖耗尽时，在培养物中可以检测到纤维素酶基因的表达。由此可见，在里氏木霉纤维素酶基因的表达过程中存在着复杂精细的碳源抑制调控机制。而大多数丝状真菌纤维素酶合成过程中，这种碳源的优先代谢阻遏作用就是通过一种阻遏蛋白Crel来实现的[30]。除此之外，在丝状真菌中还发现几类参与碳代谢阻遏蛋白Crel的同源蛋白，并且在里氏木霉和曲霉（Aspergillus）中可调控许多纤维素和半纤维素酶基因表达[31]。

3　展望

进入21世纪，纤维素酶的研究将会有着巨大的市场潜力和工业前景，木质纤维素作为地球上储量丰富的可再生资源，将其转化为可发酵的糖类，进一步发酵生产乙醇等能源物质或者其他化学产品已成为全球研究的热点。但目前的研究还存在很多难题，主要表现在关于纤维素酶的诱导物和诱导机理的研究仍然没有得出确切的结论；发酵所用的菌株生产效率低；酶系统中各组分的比例不均衡；下游分离工作繁琐，导致纤维素酶的生产成本提高等，这极大地影响了纤维素酶在工业化生产中的应用。

为更深入地研究丝状真菌在纤维素酶诱导表达过程中对外界碳源的代谢调控机制，在将来的研究中，应该充分运用现代生物技术、分子生物学和基因工程等先进的科学技术，对纤维素酶诱导过程中所涉及的基因、调控因子及代谢通路进行系统深入的研究，对基因调控模式进行探索[32]，并逐步建立丝状真菌在纤维素酶诱导合成过程中的调控模型，将有助于从分子水平上揭示丝状真菌在产酶过程中对碳源代谢的调控机理，为进一步发展纤维素酶产业提供强有力的理论指导和技术支持。

了解碳源代谢调控机制，可以利用遗传改造手段设计和改造产纤维素酶的高产菌株。此外，还能有效地控制诱导碳源，这不仅能够提高纤维素酶的产量，而且还能增加纤维素酶对纤维素底物的水解效率，还可有效地减缓代谢终产物对纤维素酶生产过程中的阻遏，满足纤维素酶在实际工业生产中的需求。随着科技的进步以及人们对纤维素酶研究的深入，相信在不久的将来，纤维素酶的应用范围会更加广泛，对社会的可持续发展发挥重要的积极作用。

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Research process of filamentous fungi on carbon source metabolism regulations during cellulase synthesis

DONG Miaoyin1,2,WANG Shuyang1,5*,WANG Yuchen1,3,XU Fuqiang1,2,LI Wenjian1,4,CHEN Jihong1,4,LIU Jing1,HU Wei1
(1.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Science,Lanzhou 730000,China; 2.College of life Science,University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China; 3.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 700070,China; 4.Gansu Engineering Laboratory of Radiation Induced Mutation Breeding,Wuwei 733001,China; 5.School of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

Filamentous fungi can secrete a large number of cellulase and can effectively degrade cellulose substrates.In the process of the cellulase synthesis,carbon sources play an irreplaceable role on enzyme-producing microorganism.But the mechanism of microbial carbon source response and metabolism regulation still not clear,which restricts the development of cellulase industry.Therefore,the effects of transcriptional regulation factors in filamentous fungi on cellulase synthesis were summarized,the fungi on carbon source metabolic regulation(including the carbon sources response and the abduction and repression of carbon sources on enzyme production process)in the process of the cellulase expression was discussed, and the research fields of cellulase were prospected.

filamentous fungi;cellulase;carbon source metabolism;regulations

Q939.97

0254-5071（2016）10-0001-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.001

2016-05-23

国家自然科学基金项目（No.11305225）；中国科学院科技服务网络计划项目（KFJ-EW-STS-086）；西藏草业专项（Y106460XZO）

董妙音（1992-），男，硕士研究生，研究方向为微生物辐照育种。

王曙阳（1974-），女，副研究员，博士，研究方向为辐射生物学。