进化工程选育乙醇发酵酵母菌株研究进展

柳洋，汤晓玉，刘义，任小利，4，丁文武*

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039；2.四川大学水利水电学院，四川成都610065；3.农业部沼气科学研究所，四川成都610041；4.四川省质量技术审查评价中心，四川成都610031）

进化工程选育乙醇发酵酵母菌株研究进展

柳洋1，2，汤晓玉3，刘义1，任小利1，4，丁文武1*

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039；2.四川大学水利水电学院，四川成都610065；3.农业部沼气科学研究所，四川成都610041；4.四川省质量技术审查评价中心，四川成都610031）

优良的酵母菌能够增强产物转化率、提高生产效率，因此选育性能优良的酵母菌一直是乙醇发酵中非常重要的工作；该文对利用进化工程选育酿酒酵母菌的研究进展进行了综述，并展望了其研究趋势，以便为这一领域的进一步深入研究提供参考和借鉴。

进化工程；酵母菌；乙醇；选育

酵母菌种是乙醇发酵工艺中最为关键的因素之一，优质、高产的酵母菌能够增强产物转化率、提高生产效率，因此选育性能优良的酵母菌是贯彻乙醇发酵始终而又十分重要的工作。

随着能源危机的日益加深，寻找可替代化石能源的可再生能源是世界各国科研工作者所面临的重要任务之一[1-2]。在众多研究中，燃料乙醇被认为是最有可能替代化石能源的可再生能源之一，但是在一些复杂发酵环境或者特殊的发酵工艺中，并不能利用普通酵母菌来进行发酵（如纤维素乙醇发酵）。由于酵母菌并不能直接利用纤维素产生乙醇，因此许多研究便开始利用各种科技手段来筛选能够直接发酵纤维素或者纤维素分解产物产乙醇的酵母菌；但是由于纤维素的分解产物非常复杂，从而形成了特殊的环境压力而导致酵母菌对纤维素产物的利用率非常低，因此在尚未弄清酵母菌株为应对这种环境压力而发生的有关分子方面变化的情况下，利用进化工程被认为是筛选适合特殊发酵环境的酵母菌的有效手段之一。

本文将对近年来利用进化工程筛选酵母菌的研究情况进行总结和探讨，以使研究者更为方便地了解这一领域的研究进展，并为其研究提供参考和借鉴。

1 进化工程选育酵母菌的研究现状

进化工程是为了获得某个既定表型菌株，在一系列选择措施的基础上进行的连续进化措施[1]，即通过模拟自然进化中的生物变异和选择过程，在人工提供选择压力的条件下使微生物进化，然后从进化的菌群中筛选出性状优良的菌株的方法[2]。

由于揭示潜在的表型提高机制变得空前简单，新生代的序列测定使得进化工程再次得到飞速发展，也使得发酵工艺通过发酵条件和额外的选择循环次数得到了进一步的提高；进化工程的发展前景也激发了新选择方案的发展，如产量选择、微流法选择胞外代谢产物等，这些无疑都将在不久的将来进一步得到发展和提高；此外，最近的研究结果也证实了一种观点—代谢工程无法证实选择发现机制，也正是如此，未来进化工程将会变得越来越重要[3]。目前，生物工程中主要是利用进化工程对菌株进行改进，以扩大其底物利用范围、提高产品生产能力或者提高菌株对环境压力的耐受性以提高其特定环境下的发酵性能。

1.1 进化工程选育发酵戊糖类的酵母菌

由于酿酒酵母菌不能以戊糖作为发酵底物来生产乙醇，但是以纤维素生产乙醇具有巨大的发展前景和优势，这使得人们不断寻找或构建能够利用木糖发酵的微生物，目前虽然已经成功构建了利用木糖的酿酒酵母菌，但是经过改造重组得到的菌株转化木糖的能力较低，由于酵母菌代谢木糖的机理尚未弄清，研究者便开始设计利用进化工程来选育木糖或乳糖代谢能力强、乙醇产量高的进化菌株[4-13]。

目前这一方向的研究也基本分为两类，一是注重菌株发酵能力的提高，通过各种进化措施提高菌株的底物利用能力、细胞量以及产乙醇能力，而对菌株发生适应性进化的机理却并未进一步深入研究[4-6]，这类研究大都是集中在利用进化工程选育菌株的早期；DEMEKE M M等[4]经过多轮复杂D-木糖培养基的进化工程选育了一株突变菌株，该菌株完全消耗35 g/L的D-木糖需要17 h，消耗速率为1.1 g/（h·g）干细胞，能够生产比母本菌株多32%的乙醇。LIU E等[5]通过脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重组技术、化学突变以及适应性进化构建了一株酵母菌，以希望找到能够有效利用木糖发酵产乙醇的菌株，通过实验，构建出的菌株的生长密度、木糖利用率以及产乙醇能力都有了很大的提高；ZHOU H等[6]以进化工程为基础设计了经过一系列间歇有氧、无氧培养以及木糖限制恒化器培养的实验，得到一株生长速率（0.203±0.006）h-1、木糖消耗速率1.866 g/（L·h）、乙醇转化率0.41 g/g的酵母菌株。

第二类是通过一定进化方案使得酵母菌有了性能提高，得到进化菌株后，又对酵母菌的进化机理做了进一步的研究[7-13]。HONGA K K等[7]利用一个水准系统检测酵母菌利用半乳糖的代谢变化，这种代谢变化是由于酵母菌因适应性进化而提高的比生长速率以及与此相关的表型特征的变化而导致的，从而筛选得到了3株比生长速率和比半乳糖吸收率都较高的进化菌株，与工程菌和参照菌相比，进化菌株的半乳糖中间代谢路线与它们相似，尽管在进化菌株中存贮的碳水化合物有所提高且一个进化菌株的麦角固醇的生物合成也发生了变化；CADIÉRE A等[8]在前期研究的基础上，继续利用进化工程增大磷酸戊糖途径的通量以增强葡萄糖的消耗能力，基于葡萄糖的13C代谢路径分析，进化菌株的碳通量已经从葡萄糖酵解转换到磷酸戊糖酵解途径上了，并且与原菌株相比，通过磷酸戊糖的通量由原来的11%提高到了17%；LEE K S等[9]通过反代谢工程将宽基因组干扰图库引入酵母菌中，然后用3种不同的富集方法得到了能够快速发酵半乳糖的转化菌株，并对能够迅速提高酵母菌性能的编码基因做了分析；SANCHEZ R G等[10]利用进化工程对携带外来基因的重组酿酒酵母菌进行选育，以提高其利用木糖和阿拉伯糖的利用率；经实验，进化菌株在无氧和有氧条件下均表现出了较高的木糖和阿拉伯糖利用率，这也是第一次以分子机制为特征对进化工程提高混合五碳糖利用率的报道；WISSELINK H W等[11]也在前期研究基础上，在利用代谢工程和进化工程筛选出阿拉伯糖发酵菌株后，对进化菌株在代谢组学、转录组学以及代谢途径等方面做了深入分析研究。SCALCINATI G等[12]构建了一株能够表达来自于毕赤酵母的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木糖激酶的酵母菌株，并用定向进化手段来提高木糖的利用率，该菌株能够消耗木糖并快速生长却只产生细胞和几乎可极少的副产物，通过对该酵母的转录图谱的研究发现，酵母呼吸机制中的乙酸途径得到了加强；RIN K S等[13]通过合理的代谢和反代谢工程，选育出能够快速有效发酵木糖的酵母菌，然后通过几轮关于木糖次代培养物的培养，选育出进化菌株，该菌株能够缩短迟滞期强化木糖发酵，通过对进化菌株的基因组序列分析发现，PHO13发生了突变，失去了Pho13p的相关作用。

由于底物的多样性以及发酵环境的不同，酵母菌的进化也不同，因此其进化机理的研究也极为复杂，研究者在这方面研究也多种多样，但是，从目前的研究来看，主要集中在以下三个方面：（1）胞内代谢产物的变化，借以推断菌株代谢路线的变化；（2）通过进化菌株和原始菌株的基因序列分析，借以分析进化菌种中基因的变化；（3）通过分析进化菌株的转录图谱，分析菌株中转录基因表达及相关作用的变化。

1.2 进化工程选育耐环境压力的酵母菌

酵母菌在发酵过程中面临这种各种各样的环境压力，这些环境压力由各种各样的因素共同构成（如发酵副产物、重金属），此外目前作为发酵底物的纤维素水解产物也包含着许多副产物（如乙酸、呋喃及其衍生物等），都是对酵母菌产生抑制的重要因素，酵母菌在这些抑制因素构成的发酵环境中，必然会发生一系列不同的进化以适应发酵环境[14]。

GILBERT A等[14]在恒浊器中利用进化工程通过检测反应器中的生物量的方法，当发现适应性菌群代替原有菌群时则进行取样筛选，从而分离出2株能耐10 g/L乙酸的酿酒酵母菌；CAKAR Z P等[15]采用了培养过程中逐步加大选择压力以及恒定温和的选择压力的两种方法，在试管中以分批培养的方法对菌株进行进化培养，获得了能够抵抗多重环境压力的进化株，其对氧化、冻融、高温和乙醇等不利条件的耐受性，分别是出发菌株的1429、102、89和62倍；YANG J等[16]利用整体转录机制工程（global transcriptional machinery engineering，gTME）构建了能够耐乙醇的酵母菌，在20%的葡萄糖发酵液的24 h实验中，所筛选出的两个菌株的生长情况很好，能够生产出比原来菌株多25%的乙醇，其比产率分别是0.31 g/g和0.39 g/g，产率分别是2.6 g/（L·h）和3.2 g/（L·h），证明了利用gTME选育出的耐乙醇的菌株可以提高乙醇的生产；HONGA M E等[17]利用反代谢工程辨别能够提高酿酒酵母菌耐乙醇的内源基因，对鉴别出的基因进行了详细的研究，揭示了有助于理解和设计代谢工程潜在耐乙醇表型的目标基因；WRIGHT J等[18]也利用了进化工程选育了能够耐乙酸的木糖发酵菌株，经过400代的选育，相继连续的间歇培养物和连续培养物能够在pH值为4的条件下，耐受乙酸质量浓度分别达到6 g/L和5 g/L，木糖消耗速率提高了75%，达到了1.7 g/（L·h）；ZELLE R M等[19]在研究中指出缺乏丙酮酸羧化酶的酵母菌不能利用葡萄糖，除非在培养液中加入C4成分，但是，经过进化工程后的突变株却能够在以葡萄糖为唯一碳源的情况下利用葡萄糖，因此在研究中ZELLE R M利用突变株和参照株研究了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶能否取代丙酮酸羧化酶所空缺的作用以及取代的条件；WENGER J W等[20]在研究中发现酵母菌在其他限碳环境而无论是有氧还是无氧条件下进化时，在需氧葡萄糖限制时表现出了很少见的“权衡”（trade-offs）现象；ADAMOGM等[21]也利用了实验室进化来提高酵母菌耐铜金属的能力，经过实验，酵母菌的耐CuSO4的能力达到了2.5 g/L，并且发现了耐铜金属不同的机制，包括铜吸收的控制、氧化应激反应的酶水平的变化以及结合铜蛋白质组的变化等。KÜÇÜKGÖZE G等[22]利用进化工程在镍压力水平渐增条件下，选育了能够抵抗参照菌株致死量5.3 mmol/L NiCl2的高抵抗镍的突变酵母菌株，而且突变株还可以交叉抵抗铁、钴、锌以及锰等，积累抵抗量比参照菌株抵抗镍量的两倍还多，通过全基因组分析，在菌株中发现了有关于铁稳态、压力响应以及氧化损伤等640个等增量调节基因，说明镍抵抗机制同样可以响应常规压力，抵抗铁、钴以及氧化损伤等环境压力；纤维素生物材料在水解过程中会产生多种糖类以及抑制因子；ALMARIO M P等[23]利用进化工程设计了实时可见进化法，分离出强适应纤维素生物材料水解产物的突变菌株，并揭示了酵母菌适应该水解产物的分子机制，研究显示最佳突变株的相对适应系数高于其母本菌株的57%，而且突变菌株对不同的抑制因子表现出了不同的抵抗机制，某些菌株的葡萄糖的吸收率也有所增加，显示出菌株对复杂纤维素水解产物的适应本性，其转录组学分析显示出一些突变菌株抵抗复杂水解产物的不同机制，以及菌株对氧化压力和耐水解产物的交叉适应性；GUADALUPE-MEDINA V等[24]利用进化工程选育出缺乏三磷酸降解酶、减少醋酸盐生成的酵母菌，加强了无氧高糖浓度条件下菌株的生长，实验发现，突变株的甘油生成量比参照菌株大约少10%，而乙醇得率从79%上升至92%，基因分析显示，增强好氧条件下的渗透耐力，需要一个主要的染色体突变以及一个在生成质粒中的厌氧生长基因。ALKIM C等[25]利用利用经典的遗传和基因组宽转录子，分析了以进化工程选育出的酵母菌抗钴表型的特征；KOPPRAM R等[26]利用进化工程在间歇培养基和恒化器培养基中，选育出3株能够忍耐云松水解产物抑制因子的进化菌株，与母本菌株相比，进化菌株的比生长速率提高了2倍，迟滞期下降为原来的一半，发酵糖的时间也有所缩短。

此外，有学者也利用进化工程选育了适合反复真空发酵的酿酒酵母菌，并利用蛋白质组学、代谢组学和脂质组学对选育出的酵母的适应性进化做了详细分析，取得非常丰硕的研究成果[28-30]，四川大学肖泽仪课题组也膜生物反应器乙醇发酵过程中副产物对发酵的影响，以利用进化工程选育适合膜生物反应器乙醇发酵的酵母菌，取得了显著成果[33-34]。

针对响应发酵环境压力的进化酵母菌，研究内容也基本可分为两类：一类是针对发酵产物乙醇或副产物乙酸以及纤维素水解产物等对酵母菌产生的抑制，通过一定的进化措施提高酵母菌株的耐乙醇或乙酸抑制作用的能力[18，23-24，26-36]；另一类是针对发酵液中的重金属如铜、钴、镍等形成的环境压力，设计一定的实验方案，逐渐对酵母菌实行驯化，提高酵母菌耐重金属毒性的能力[21-22，25]，除此还有针对一些特殊的发酵环境而进行研究的，如酵母菌面临的氧化、冻融、高温等环境[15]。

以上研究所进行的内容和采取的手段也多种多样，但总结起来可以归纳为以下几个方面：（1）细胞内代谢产物的研究，借以研究代谢路径的变化，（2）是关键酶等蛋白质的研究，借以分析细胞为应对环境压力在关键酶方面的变化，（3）是对细胞内的关键基因的分析研究，借以分析细胞在进化过程中，为适应环境压力而发生的基因变化，在这些研究中，基本上都运用了生物化学和分子生物学的知识，以代谢组学、转录组学、蛋白质组学和基因组学等技术方法进行研究。

2 总结与展望

通过文献报道可以看到，经过研究者多年的努力，利用进化工程选育适合一定发酵环境的酵母菌这一领域有了很大的进展，也都取得了较好的研究结果，所获得的菌株其性能都得到了一定程度的提高，同时，对进化菌株性能的进一步研究，分别在基因、关键酶或代谢途径都取得了一定的进展，但是这些研究仍然不够深入，所得结果往往是初步探索，尤其是在耐环境压力的分子机制上的探索，是近年来随着相应的研究技术的增强才逐步开始快速发展的，因此需要进一步加强深入，且需要将酵母的表型性能与分子机理相关联，并需要借鉴和比较前人的研究结果，以便从更深的层次上认识细胞耐环境压力的机制，从而为有针对性的菌株选育和发酵工艺改进奠定基础。

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Research progress on breeding of yeast strains for alcoholic fermentation by evolutionary engineering

LIU Yang1,2,TANG Xiaoyu3,LIU Yi1,REN Xiaoli1,4,DING Wenwu1*
(1.College of Food and Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.College of Water Resource and Hydropower,Sichuan University,Chengdu 610065,China; 3.Biogas Institute of Ministry of Agriculture,Chengdu 610041,China; 4.Sichuan Quality and Technical Examination Center,Chengdu 610031,China)

Ethanol productivity and yield could be elevated with super yeast strains during ethanol fermentation,so super yeast strains breeding is always conducted as a very important work in the ethanol fermentation industry all the time.The research progress of the yeast breading by evolutionary engineering were summarized in the article.The trend of the aspect was also discussed to provide references for the researchers in the field.

evolutionary engineering;yeast;ethanol;breeding

TS201.3

0254-5071（2016）11-0026-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.005

2016-07-14

四川省教育厅项目（15ZB0126）；四川省科技支撑计划项目（15205613）；西华大学校重点科研基金项目（z1420523）；四川省高校重点实验室开放项目（szjjz015-001）；西华大学大学生创新创业训练项目（05030153）

柳洋（1995-），男，硕士研究生，研究方向为可再生能源开发。

*通讯作者：丁文武（1980-），男，副教授，博士，研究方向为微生物发酵与生物质能源转化。