应用LAMP技术鉴别猪牛羊肉

杨军霞 ， 雷程红 ， 王振宝 ， 葛 婷 ， 卞赛赛 ， 王旭蕾 ， 徐 剑

(1．新疆农业大学科学技术学院， 新疆乌鲁木齐830052；2．新疆农业大学动物医学学院， 新疆乌鲁木齐830052； 3．伊犁出入境检验检疫局， 新疆伊宁835000)

应用LAMP技术鉴别猪牛羊肉

杨军霞1， 雷程红2， 王振宝3， 葛 婷2， 卞赛赛2， 王旭蕾1， 徐 剑1

(1．新疆农业大学科学技术学院， 新疆乌鲁木齐830052；2．新疆农业大学动物医学学院， 新疆乌鲁木齐830052； 3．伊犁出入境检验检疫局， 新疆伊宁835000)

肉类是否掺假是消费者在购买肉制品时比较注意的问题，用猪肉、鸡肉、鸭肉等价格便宜的肉掺入牛羊肉及其肉制品中，是牛羊肉制品最常见的掺假方式[1]。近年来，肉类掺假问题已引起社会广泛关注[2]。为了解牛羊肉制品中掺加猪肉情况，我们对霍尔果斯市几家超市的牛羊肉及其肉制品进行了检测。

1 材料与方法

1.1 样品 新鲜的牛肉、羊肉、猪肉、马肉，火锅用的羊肉卷，清真牛肉火腿肠，撒尿牛丸，牛肉丸子，鸡肉火腿肠(成分中标明有猪肉)。

1.2 引物 猪线粒体COXI基因LAMP引物参照杨丽霞等方法[3]，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。

1.3 主要试剂 组织基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，BstDNA聚合酶(NEB)，SYBR Green-I核酸染料(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，PremixTaq酶、dNTPs、DL-2000 DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司)。

1.4 主要仪器设备 LAMP实时浊度仪LA-320，电泳仪，紫外光度计，凝胶成像仪，恒温温匀器，冰箱，离心机，微量移液器。

1.5 样品组织基因组的提取 按照组织基因组提取试剂盒的操作说明书进行。

1.6 猪线粒体COXI基因LAMP扩增 LAMP反应体系为25 μl：2*反应缓冲液12.5 μL，引物混合物1.0 μL，BstDNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，双蒸水8.5 μL。反应管涡旋混匀后置于LAMP实时浊度仪中，设置63 ℃ 60 min，80 ℃10 min扩增。反应体系中的模板分别为猪肉基因组DNA、牛肉基因组DNA、羊肉基因组DNA、马肉基因组DNA、双蒸水(空白对照)、待检样品基因组DNA。

2 结果

猪线粒体COXI基因LAMP扩增结果 63 ℃反应30 min时，猪肉基因组DNA反应管在浊度仪上的柱状图底部显示为红色，表示已经扩增出猪肉线粒体COXI基因。而牛、羊、马肉基因组DAN反应管和空白对照管对应的柱状图底部为黄色，说明没有扩增出猪肉线粒体COXI基因，见中插彩版图1所示。肉眼观察阳性扩增产物，未见有明显的颜色变化，但离心后可见有明显的白色沉淀。扩增产物中加入SYBR Green-I核酸染料1 μL，混匀后置于紫外仪中观察，可见阳性扩增产物有荧光，阴性扩增产物没有荧光而是呈现染料本来的橘红色，见中插彩版图2所示。

用LAMP法共检测9种肉及其肉制品，新鲜的猪肉、鸡肉火腿肠(商品成分中标明有猪肉)，猪线粒体COXI基因LAMP扩增结果为阳性；新鲜的牛肉、羊肉、马肉，火锅用的羊肉卷，清真牛肉火腿肠，撒尿牛丸，牛肉丸子中，猪线粒体COXI基因LAMP扩增结果均为阴性。

3 讨论

依靠感官检验很难检测出牛羊肉及其肉制品的掺加肉。近年来，食品中肉类成分的鉴别和分析已逐步采用蛋白检测和核酸检测技术，这些技术对肉品种类的检测可检测到属和亚属级别，敏感度可达到纳克级别[4]。本次调查中，采用了检测核酸的LAMP技术，该技术特异性强、敏感度高，反应耗时短，技术和设备要求低[5-6]。该方法一旦建立，很适合在基层使用。在本试验我们用在LAMP浊度仪中筛选出的最佳反应温度和时间在恒温温匀器中进行LAMP反应，其结果与浊度仪的一致。但由于反应后反应管颜色变化不明显，需离心沉淀或加入核酸染料后方可判定结果。开盖加入染料时有可能产生气溶胶污染而造成假阳性出现，这点在试验时应予注意。

本次调查的超市中的牛羊肉及其肉制品，未检出其中掺加有猪肉。

[1] 李宗梦，赵良娟，赵宏，等.肉及肉制品动物源性成分鉴别技术研究进展[J].食品研究与开发，2014，35(18)：122-126.

[2] 钟贤武，林虹，谈宇菲，等.欧洲“马肉事件”案例分析[J].华南预防医学，2013，39(6)：51-56.

[3] 杨丽霞，付淑君，彭新凯.环介导等温扩增法检测牛羊肉中的猪肉成分[J].食品与机械，2013，29(5)：63-65.

[4] 何玮玲，黄明，张驰.食品中肉类成分种属鉴别技术研究进展[J].食品科学，2012，33(3)：304-307.

[5] 侯东军，杨红菊，于雷，等.环介导恒温扩增法鉴定牛羊肉中的搀杂肉[J].食品工业科技，2012，33(22)：60-62.

[6] 李向丽，刘垚，谭贵良，等.基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分[J].中国食品卫生杂志，2015，27(3)：247-252.

2015-10-12

新疆农业大学科学技术学院大学生科技创新基金项目资助(2015KCX18)

杨军霞(1992- )，女，本科生,就读于动物医学专业,E-mail:1209122156@qq.com

雷程红，E-mail:leichxjnd@aliyun.com

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0529-6005(2016)12-0082-01