microRNA在成骨分化和骨代谢疾病中对Wnt信号通路调控作用的研究进展

陈 熙 郭健民 邹 军

(上海体育学院运动科学学院，上海 200438)

microRNA在成骨分化和骨代谢疾病中对Wnt信号通路调控作用的研究进展

陈 熙1郭健民 邹 军2

(上海体育学院运动科学学院，上海 200438)

microRNA；Wnt信号通路；成骨分化；骨代谢疾病

MicroRNA(miRNA，miRNAs)是一类长度在18-22nt的非编码RNA，可以通过与靶基因的UTRs(3′-untranslated regions)结合使基因沉默或诱导mRNA降解、阻断蛋白的翻译来抑制靶基因的表达〔1〕。Wnt信号通路主要分为经典的Wnt/β-catenin信号通路和非经典的Wnt信号通路(钙离子依赖的Wnt信号通路和Wnt细胞极性信号通路)。到目前为止有19个不同的Wnt蛋白(Wnt1，Wnt2，Wnt2B，Wnt3，Wnt4，Wnt5A，Wnt5B，Wnt6，Wnt7A，Wnt8A，Wnt8B，Wnt9A，Wnt9B，Wnt10A，Wnt10B，Wnt11，Wnt16)被发现，其在骨骼的发育和稳定中起着关键性作用〔2〕。最新研究发现microRNA可以调控Wnt信号通路关键因子的表达〔3〕。通过查阅相关文献综述其最新研究进展，为进一步研究提供理论基础。

1 Wnt信号通路的信号传导

经典的Wnt信号接收和传递需要Wnt蛋白与细胞表面受体蛋白Frizzled(Fzd)基因家族和辅助低密度脂蛋白受体蛋白(LRP)基因家族相结合〔4〕；使骨架蛋白(Dsh)激活来抑制糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的活化。非激活的GSK-3β不能使β-catenin磷酸化，从而使β-catenin免于被蛋白酶复合物降解，继而进入细胞核内与转录因子(Tcf7和Lef1)相关联实现对相关基因表达的调控〔5〕。经典的Wnt信号通路是成骨前体细胞分化、组织钙化平衡、诱导潜能细胞和成骨前体细胞增殖、保持成骨细胞和骨细胞活性所必不可少的〔6〕。

钙离子依赖的Wnt通路的信号传导〔7〕：Wnt蛋白与受体Fzd相结合形成一个三蛋白复合物 Dsh-Axin-GSK，这个复合物可以调控辅助受体Ror1/2(tyrosine-protein kinase transmembrane receptor 1/2)的磷酸化。Wnt蛋白与受体Fzd、辅助受体Ror1/2的结合可以激活磷脂酶C(PLC)从而使三磷酸肌醇(IP3)、甘油三酯(DAG)和细胞内钙离子的浓度升高，对下游的细胞功能进行调节〔8〕。细胞极性通路的信号传导〔9〕：Wnt蛋白与Fzd以及一个辅助受体(Ror2或Ryk)相结合，从而使细胞骨架蛋白Rho相关蛋白激酶(ROCK)活化进而对c-Jun氨基末端液酶(JNK)进行调节，使其激活并对下游的转录因子进行调控。

2 microRNA通过调控Wnt信号通路在成骨分化中的作用

2.1 microRNA促进成骨分化

2.1.1 直接调控 Su等〔10〕通过生物学信息和功能测定发现miR-26a通过靶基因GSK3β实现对Wnt信号通路的调控；miR-26a的过表达可以增加骨髓间充质干细胞β-catenin表达，反之降低其表达。这表明miR-26a可以通过增加Wnt信号通路的表达促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。Wang等〔11〕研究发现GSK-3β是miR-346的靶基因，诱导人的骨髓间充质干细胞向成骨分化后miR-346的表达增加，miR-346可以通过抑制GSK-3β的表达来激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进人的骨髓间充质干细胞向成骨分化。

2.1.2 间接调控 Li等〔12〕研究发现GSK3β和DKK1都是miR-29a的直接靶标，肿瘤坏死因子(TNF)-α可以通过抑制β-catenin的表达来抑制成骨细胞分化，miR-29a的过表达可以减弱TNF-α对成骨分化的抑制作用；这表明miR-29可以通过对其靶标GSK3β和人Oickkop相关蛋白1(DKK1)的抑制作用来激活Wnt信号通路，从而促进成骨分化。在经典的Wnt信号通路中，Wnt配体通过与蛋白受体(Frizzled 、LRP5/6)相结合来激活Wnt信号通路〔13〕，分泌型细胞外糖蛋白(sFRPs)包含一个与Frizzled 蛋白结构相似的区域，可直接与Wnt配体相结合，从而作为Wnt信号通路的内源性拮抗剂抑制Wnt信号通路〔14〕。Guo等〔15〕研究发现sFRPs是miR-27a的靶标，在人Sv40转染成骨细胞(hFOB1.19)中miR-27a可以通过抑制sFRPs的表达，来激活Wnt信号通路，从而促进成骨细胞的增殖和分化。Zhang等〔16〕研究发现SFRP2和DKK2都是miR-218的靶基因，miR-218表达增加会显著降低其靶基因SFRP2和DKK2的表达；在人脂肪来源干细胞中添加miR-218模拟物可以增加成骨标志物的表达、碱性磷酸酶(ALP)活性，同时使Wnt的表达增加。这表明miR-218可以通过抑制SFRP2和DKK2的表达，来激活Wnt信号通路，促进人脂肪干细胞向成骨分化。Zhang等〔17〕研究发现在小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)中，miR-335-5p可以通过抑制其靶基因DKK1的表达，来激活经典的Wnt信号通路从而促进成骨分化。Sost编码的硬化蛋白可以干扰Wnt配体与Lrp5/6受体的结合，是Wnt信号通路的拮抗剂〔18〕。Chen等〔19〕研究发现Sost是miR-204的靶基因，miR-204的表达增加可以抑制Sost的水平。这表明miR-204可以通过抑制Sost的表达来激活Wnt信号通路，促进成骨分化。MiR-142-3p的过表达可以促进Hfob1.19细胞的分化，miR-142-3p可以通过抑制靶基因腺瘤性结肠息肉病(APC)的表达来促进β-catenin的表达，从而促进成骨分化〔20〕。

MicroRNA可以通过直接调控GSK3β使Wnt信号通路激活，从而促进成骨分化；同时也可以通过抑制Wnt信号通路的抑制剂的表达，间接地增加Wnt的表达促进成骨分化。

2.2 microRNA抑制成骨分化 Wu等〔21〕研究发现在骨髓间充质干细胞中添加miR-128模拟物会降低神经元细胞标志物mRNA和蛋白的表达水平，miR-128可以降低Wnt3a的表达，进一步通过生物学信息分析证明Wnt3a是miR-128的一个靶基因。这表明在骨髓间充干细胞中miR-128可以通过对其靶基因Wnt3a的调控，从而对骨髓间充质干细胞向神经元细胞的分化进行调控。Shi等〔22〕用地塞米松干预成骨细胞后发现miR-199a-5p的表达显著增加，通过沉默或过表达miR-199a-5p发现，miR-199a-5p可以显著增强地塞米松抑制成骨细胞增殖的作用；miR-199a-5p可以通过与WNT2的3′-UTR相结合从而抑制其表达，这表明miR-199a-5p可以通过调控Wnt信号通路在成骨细胞增殖中发挥关键性的作用。

Li等〔23〕通过细胞转染发现添加miR-10a模拟物可以下调MC3T3-E1细胞β-cateninmRNA和蛋白的表达，miR-10a过表达会抑制MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化，其主要是通过调控β-catenin的表达实现。在人骨髓间充质干细胞中miR-141和miR-22的表达增加会抑制ALP活性，下调成骨标志物的表达同时减缓钙化结节的形成；进一步通过生物学信息分析发现β-catenin是miR-141和miR-22的靶基因，这表明miR-141和miR-22可通过抑制β-catenin的表达来抑制成骨分化〔24〕。Wang等〔25〕研究发现LRP6(low-density lipoprotein receptor-related protein 6)是miR-30e的直接靶标，miR-30e表达增强会降低LRP6和β-catenin蛋白的表达；在小鼠的骨髓基质细胞中miR-30e通过抑制LRP6的表达，促进其成脂分化抑制成骨分化。这表明miR-30e可以作为骨质疏松治疗潜在的靶标。T细胞因子3(TCF3)是经典的Wnt信号通路的一个转录因子，无论是在体内还是在体外TCF3均可促进成骨分化；Liu等〔26〕使用靶基因预测软件筛选发现，Wnt信号通路的三个关键转录因子TCF3、TCF4、LEF1是miR-17潜在的靶基因，并进一步通过荧光素酶靶基因报告发现TCF3是miR-17的靶基因，在人的牙周膜干细胞中miR-17可以通过抑制TCF3的表达来抑制Wnt信号通路，从而抑制成骨分化。

miRNA可以通过直接调控Wnt蛋白的表达、Wnt信号通路的受体、转录因子以及其关键因子β-catenin的表达来抑制Wnt信号通路的激活，从而抑制成骨分化。

3 Wnt相关的骨代谢疾病中microRNA对Wnt的调控

2，3-已糖胺途径(HBP1)是Wnt信号通路的内源性抑制剂。Sun等〔27〕研究发现HBP1是miR-155的靶标，miR-155可以抑制HBP1的表达；在骨肉瘤细胞中miR-155通过抑制HBP1的表达来激活Wnt信号通路，为骨肉瘤的临床治疗提供了潜在的选择。神经管畸形相关蛋白(VANGL2)属于非经典的Wnt信号通路，Althoff等研究发现与VANGL2是miR-542-3p的靶基因，miR-542-3p可以抑制U2O细胞VANGL2的表达；此外miR-542-3p通过抑制VANGL2的表达来抑制非经典的Wnt信号通路，从而在骨肉瘤的发病中起到致癌基因的作用〔28〕。Wei等〔29〕研究发现miR-217在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中的表达下调，在骨肉瘤细胞中Wnt5a促进细胞的增殖转移，进一步研究发信Wnt5a是miR-217靶基因，在骨肉瘤中miR-217可以通过下调Wnt5a的表达来抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移。此外研究发现，与正常的成骨细胞相比骨肉瘤细胞系中miR-214的表达降低，Ror2表达增加；miR-214可以通过抑制其靶基因Ror2的表达来，来抑制非经典的Wnt的信号通路的激活〔30〕。

B细胞淋巴因子9(BCL9)是β-catenin蛋白转录的激活因子〔31〕，在多发性骨髓瘤(MM)中Wnt信号通路的激活可以促进MM细胞的增殖、存活、迁移和耐药性同时可以促进MM肿瘤干细胞的形成〔32〕。Zhao等研究发现BCL9是miR-30c的靶标，在多发性骨肉瘤中miR-30s的表达降低，从而使BCL9的表达增加Wnt信号通路激活；此外在异体移植的小鼠MM模型中，miR-30c可以抑制MM细胞的增殖、迁移、侵袭并诱导期凋亡〔33〕。这为探究MM的发病机制和治疗提供了依据。

研究发现在骨肉瘤与MM中microRNA可以对Wnt信号通路的关键性转录因子进行调控，从而在两者的发病中发挥关键性作用；同时也为骨肉瘤和MM的治疗提供了潜在的靶基因。

综上所述，Wnt信号通路是重要的骨代谢通路，在成骨分化以及骨代谢疾病中发挥关键性的作用。microRNA可以直接或间接的通过调控Wnt信号通路对成骨分化产生影响。同时microRNA也可以在骨肉瘤和多发性骨髓瘤中对Wnt信号进行调控，成为其潜在的致病基因或治疗靶基因。这为明确骨代谢疾病如骨肉瘤、MM以及与成骨分化有关的骨质疏松的发病机制的研究以及临床治疗提供潜在的途径。

1 Huntzinger E，Izaurralde E.Gene silencing by microRNAs：contributions of translational repression and mRNA decay〔J〕.Nat Rev Genet，2011；12(2)：99-110.

2 Lerner UH，Ohlsson C.The WNT system：background and its role in bone〔J〕.J Intern Med，2015；277(6)：630-49.

3 Mahmood S，Bhatti A，Syed NA，etal.The microRNA regulatory network：a far-reaching approach to the regulate the Wnt signaling pathway in number of diseases〔J〕.J Recep Sign Transduc Res，2016；36(3)：310-8.

4 Bejsovec A.Wnt signaling：an embarrassment of receptors〔J〕.Curr Biol，2000；10(24)：R919-22.

5 Eastman Q，Grosschedl R.Regulation of LEF-1/TCF transcription factors by Wnt and other signals〔J〕.Curr Opin Cell Biol，1999；11(2)：233-40.

6 Khosla S，Westendorf JJ，Oursler MJ.Building bone to reverse osteoporosis and repair fractures〔J〕.J Clin Invest，2008；118(2)：421-8.

7 Kohn AD，Moon RT.Wnt and calcium signaling：beta-catenin-independent pathways〔J〕.Cell Calcium，2005；38(3-4)：439-46.

8 Kuhl M.The WNT/calcium pathway：biochemical mediators，tools and future requirements〔J〕.Front Biosci，2004；9：967-74.

9 Jenny A.Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye〔J〕.Curr Top Dev Biol，2010；93：189-227.

10 Su X，Liao L，Shuai Y，etal.MiR-26a functions oppositely in osteogenic differentiation of BMSCs and ADSCs depending on distinct activation and roles of Wnt and BMP signaling pathway〔J〕.Cell Death Dis，2015；6：e1851.

11 Wang Q，Cai J，Cai XH，etal.miR-346 regulates osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by targeting the Wnt/beta-catenin pathway〔J〕.PLoS One，2013；8(9)：e72266.

12 Li C，Zhang P，Gu J.miR-29a modulates tumor necrosis factor-alpha-induced osteogenic inhibition by targeting Wnt antagonists〔J〕.Dev Growth Diff，2015；57(3)：264-73.

13 Liu G，Vijayakumar S，Grumolato L，etal.Canonical Wnts function as potent regulators of osteogenesis by human mesenchymal stem cells〔J〕.J Cell Biol，2009；185(1)：67-75.

14 Suzuki H，Watkins DN，Jair KW，etal.Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer〔J〕.Nat Genet，2004；36(4)：417-22.

15 Guo D，Li Q，Lv Q，etal.MiR-27a targets sFRP1 in hFOB cells to regulate proliferation，apoptosis and differentiation〔J〕.PLoS One，2014；9(3)：e91354.

16 Zhang WB，Zhong WJ，Wang L.A signal-amplification circuit between miR-218 and Wnt/beta-catenin signal promotes human adipose tissue-derived stem cells osteogenic differentiation〔J〕.Bone，2014；58：59-66.

17 Zhang J，Tu Q，Bonewald LF，etal.Effects of miR-335-5p in modulating osteogenic differentiation by specifically downregulating Wnt antagonist DKK1〔J〕.J Bone Miner Res，2011；26(8)：1953-63.

18 Semenov M，Tamai K，He X.SOST is a ligand for LRP5/LRP6 and a Wnt signaling inhibitor〔J〕.J Biol Chem，2005；280(29)：26770-5.

19 Chen Q，Liu W，Sinha KM，etal.Identification and characterization of microRNAs controlled by the osteoblast-specific transcription factor osterix〔J〕.PLoS One，2013；8(3)：e58104.

20 Qi X，Li J，Zhou C，etal.MiR-142-3p suppresses SOCS6 expression and promotes cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；36(5)：1743-52.

21 Wu R，Tang Y，Zang W，etal.MicroRNA-128 regulates the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells by Wnt signaling〔J〕.Mol Cell Biochem，2014；387(1-2)：151-8.

22 Shi C，Huang P，Kang H，etal.Glucocorticoid inhibits cell proliferation in differentiating osteoblasts by microRNA-199a targeting of WNT signaling〔J〕.J Mol Endocrinol，2015；54(3)：325-37.

23 Li J，Zhang Y，Zhao Q，etal.MicroRNA-10a influences osteoblast differentiation and angiogenesis by regulating beta-catenin expression〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；37(6)：2194-208.

24 Liang WC，Fu WM，Wang YB，etal.H19 activates Wnt signaling and promotes osteoblast differentiation by functioning as a competing endogenous RNA〔J〕.Sci Rep，2016；6：20121.

25 Wang J，Guan X，Guo F，etal.miR-30e reciprocally regulates the differentiation of adipocytes and osteoblasts by directly targeting low-density lipoprotein receptor-related protein 6〔J〕.Cell Death Dis，2013；4：e845.

26 Liu W，Liu Y，Guo T，etal.TCF3，a novel positive regulator of osteogenesis，plays a crucial role in miR-17 modulating the diverse effect of canonical Wnt signaling in different microenvironments〔J〕.Cell Death Dis，2013；4：e539.

27 Sun X，Geng X，Zhang J，etal.miR-155 promotes the growth of osteosarcoma in a HBP1-dependent mechanism〔J〕.Mol Cell Biochem，2015；403(1-2)：139-47.

28 Althoff K，Lindner S，Odersky A，etal.miR-542-3p exerts tumor suppressive functions in neuroblastoma by downregulating Survivin〔J〕.Int J Cancer，2015；136(6)：1308-20.

29 Wei R，Deng Z，Su J.miR-217 targeting Wnt5a in osteosarcoma functions as a potential tumor suppressor〔J〕.Biomed Pharmacother，2015；72:158-64.

30 Zhang C，Hu Y，Wan J，etal.MicroRNA-124 suppresses the migration and invasion of osteosarcoma cells via targeting ROR2-mediated non-canonical Wnt signaling〔J〕.Oncol Rep，2015；34(4)：2195-201.

31 Kramps T，Peter O，Brunner E，etal.Wnt/wingless signaling requires BCL9/legless-mediated recruitment of pygopus to the nuclear beta-catenin-TCF complex〔J〕.Cell，2002；109(1)：47-60.

32 Derksen PW，Tjin E，Meijer HP，etal.Illegitimate WNT signaling promotes proliferation of multiple myeloma cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2004；101(16)：6122-7.

33 Zhao JJ，Lin J，Zhu D，etal.miR-30-5p functions as a tumor suppressor and novel therapeutic tool by targeting the oncogenic Wnt/beta-catenin/BCL9 pathway〔J〕.Cancer Res，2014；74(6)：1801-13.

〔2015-09-29修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金项目(81572242)；上海市人类运动能力开发与保障重点实验项目(上海体育学院)(No.11DZ2261100)；上海体育学院研究生教育创新计划(yjscxz2015007)

邹 军(1969-)，男，教授，博士生导师，主要从事运动与防治骨质疏松研究。

陈 熙(1982-)，男，讲师，博士，主要从事运动与防治骨质疏松研究。

R681

A

1005-9202(2016)24-6293-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.120

1 温州医科大学体育科学学院 2 上海体育学院发展规划处