补肾助孕方调节生殖轴促进胚胎着床的机制探讨*

戴佳轩，徐建亚，谢 彤，蒋凤荣，姜 淼，周伯如，周惠芳

(南京中医药大学，南京 210023)

补肾助孕方调节生殖轴促进胚胎着床的机制探讨*

戴佳轩，徐建亚，谢 彤，蒋凤荣，姜 淼，周伯如，周惠芳△

(南京中医药大学，南京 210023)

补肾助孕方是基于国医大师夏桂成教授提出的“心(脑)-肾-子宫轴”理论指导下形成的经验方剂。临床研究已证实，其为治疗黄体功能不全性(LPD)不孕症的有效方药，并能提高患者胚胎着床期P、LH等水平，实验结果提示其能改善卵巢黄体功能及子宫内膜容受性。基于中西医对LPD性不孕为生殖轴功能失调认识上的一致性，课题组认为补肾助孕方能够作用于垂体，提出“通过GnRH受体后信号通路调控垂体GTH表达进而调节生殖轴功能”的作用新机制假说。首次从GnRH受体后PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信号通路，开创性地研究补肾助孕方对垂体GTH表达分泌的调控及补肾法治疗LPD的助孕新机制，为中药治疗LPD不孕症的研究提供新思路和新方法。

补肾助孕方;黄体功能不全;促性腺激素;GnRH受体;信号通路

世界卫生组织将不孕不育列入医学界危害人类健康的三大难治性疾病之一，其发病率近年来呈上升趋势，可能与晚婚晚育、人工流产、性传播疾病、女性工作节奏加快压力增加而致焦虑等有关。黄体功能不全(luteal phase defect，LPD)是导致育龄妇女妊娠失败的直接重要原因，其临床特点是不孕和反复早期流产，其中约有3.5%～10%的不孕症、35%的早期妊娠流产和4%的习惯性流产是由LPD所引起的［1-2］。目前，LPD的病因及机制仍未完全明了，多种可造成女性不孕不育的生殖内分泌疾病亦可导致LPD［3］。临床上治疗LPD的激素支持疗法存在种种缺陷［4-7］。

周惠芳教授20余年来跟随国医大师夏桂成教授对女性生殖理论和临床进行了系统研究和创新，尤其是对黄体功能不全性不孕症从临床到基础、从发病因素、物质基础、治疗效果及中医药有效机制诸方面都进行了深入探讨，将名老中医的学术思想、临证经验和现代研究相结合，总结出适合现代临床实际运用的新理论和新方法。

1 补肾助孕方理法方药

中医学尚无“黄体功能不全”、“胚胎着床障碍”之说，根据其证候属于“不孕症”“胎漏、胎动不安”“滑胎”“月经失调”等范畴。肾藏精主生殖，肾气的盛衰与生殖关系密切。肾气旺盛，任通冲盛，两精相搏，才能受孕。肾主冲任，诸因损及肾，伤及冲任，均可致肾失封藏，冲任不固，胞胎失养，胎元无以维系，胚胎无以着床而不孕。国医大师夏桂成教授带领团队，经历长达半个多世纪的临床实践，完善了以“心(脑)-肾-子宫轴”、“经间期学说”、“调整月经周期节律法”等创新学说为主体的中医女性生殖节律调节理论，相关研究成果“中医女性生殖节律理论创新及临床应用”获2011年江苏省科技进步一等奖。

夏桂成所创立的补肾调周法，意在调整心(脑)-肾-子宫生殖轴，使之恢复到正常的女性生理状态。他指出:“肾藏精，亦主骨髓，精能生髓，心藏神，主神明，脑为髓海、为元神之府，心脑为神之所藏，精神互依，精能养神，神能驭精(包括生殖之女精)，是以心脑神明才是驾驭排卵之所在。心脑通过骨髓与肾相关联，子宫之排经、受孕、分娩，肾之分泌天癸、精卵，均与心脑神明有关，精神合一、心肾相交、在心(脑)－肾－子宫生殖轴的纵横反馈的作用下，才能维护女性生殖方面的阴阳消长转化的调节功能。”另外，“通过肝脾升降疏泄而致气血之间的活动，纠正阴阳消长转化运动中的太过与不及，以保证阴阳运动的动态平衡，从而也就间接地保证了心肾之间的交合。故在补肾调周法特别是在经前期补肾助阳法的前提下，兼用疏肝宁心的方法，安定心肝魂魄，更有利于调经助孕种子”［8］。

作为课题组长，夏桂成带领课题组长期研究积累得出LPD性不孕症临床的病因病机主要是肾虚偏阳夹有肝郁，所以补肾助阳，佐以疏肝是治疗LPD性不孕症经前期的大法，并逐渐筛选改良形成了经验方剂补肾助孕方(原名妇孕1号、助孕汤、助孕合剂，由炒白芍、淮山药、山萸肉、醋柴胡、莵丝子、鹿角片等8味中药组成)。方中以鹿角片补肾助阳为君药，莵丝子平补肾阴肾阳，炒白芍、淮山药、山萸肉等补肾中阴精共为臣药，佐以醋柴胡疏肝解郁鼓舞阳气，诸药相合在经前期(确定排卵后)使用，具有使“阳长至重”、舒畅心肝气机、安定心肝魂魄，从而矫正心(脑)-肾-子宫生殖轴，有利于调经助孕。

2 补肾助孕方临床研究

早在20世纪80年代，课题组在大量临床研究基础上，将上方制成院内制剂助孕合剂，为LPD性不孕症提供了有效的中药制剂，并先后开展了2次临床研究。

2.1 对肾虚肝郁型LPD不孕症患者的临床疗效观察

补肾助孕方临床治疗202例肾虚肝郁型LPD性不孕症，患者月经规则、经前腰膝酸软、乳房胀痛等临床症状消除或改善，基础体温(BBT)明显改善，雌二醇(E2)、孕酮(P)水平均显著升高，泌乳素(PRL)水平明显下降，受孕率 38.61%，好转率55.90%，总有效率达94.51%［9］。

2.2 对多囊卵巢综合症肾虚肝郁型LPD性不孕症临床疗效观察

补肾助孕方临床治疗30例多囊卵巢综合症肾虚肝郁型LPD性不孕症，结果提示该方能显著提高患者胚胎着床期P、E2、黄体生成素(LH)水平，降低子宫及卵巢动脉血流阻力，增加子宫及卵巢动脉灌注量与血管壁的通透性［10］。

3 补肾助孕方实验研究

在上述临床研究基础上，周惠芳教授带领团队又先后主持2项江苏省自然科学基金项目，进一步通过体内外动物实验，对补肾助孕方健全黄体功能、促进胚胎着床的作用机制进行了研究探索。

3.1 对高泌乳素模型大鼠血清 PRL、P和 E2水平的影响

课题组用胃复胺造成SD大鼠高泌乳素模型，以安宫黄体酮为阳性对照药，检测助孕合剂大、小剂量组对各组SD大鼠E2、P、PRL的影响。结果表明，助孕合剂2剂量组均能明显提高SD大鼠E2、P水平，降低PRL的水平［11］。

3.2 对LPD模型大鼠子宫内膜及卵巢的影响

课题组用米非司酮为模型剂，地屈孕酮为西药对照药，将SD雌性大鼠随机分成空白组、模型组、西药组和中药补肾助孕方低、中、高剂量组，光镜观察子宫内膜及卵巢的形态，透射电镜观察卵巢黄体细胞的超微结构，同时采用Western blot技术分析各组大鼠胚胎着床期子宫内膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及整合素αⅤ、β3的蛋白表达等。实验结果发现，补肾助孕方能同时作用于卵巢和子宫内膜，改善其结构和形态;主要是改善卵巢线粒体内质网的结构和形态，改善子宫内膜腺体和间质结构，能有效下调SD大鼠胚胎着床期子宫内膜中ER、PR的蛋白水平表达，并能显著提高整合素αⅤ、β3的蛋白水平表达，改善黄体功能不全状态子宫内膜的容受性，为受孕创造良好环境［12-15］。

3.3 含药血清对大鼠子宫内膜细胞的影响

课题组取未成年SD雌鼠分泌期子宫内膜细胞体外培养，加药干预48 h后，采用Q-PCR法检测补肾助孕方药高、低剂量含药血清对子宫内膜细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9m)RNA、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3m)RNA的表达，同时采用放免法检测细胞上清液MMP-9、基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的含量。实验结果表明，补肾助孕方药能提高子宫内膜细胞MMP-9mRNA的表达及细胞上清液 MMP-9m、TIMP-1水平，同时下调子宫内膜细胞caspase-3mRNA的表达，降低细胞的凋亡，有利于提高子宫内膜容受性和胚胎着床，提高临床妊娠率［16-17］。

4 结语及展望

前期研究表明，一方面补肾助孕方直接作用于生殖轴的下游卵巢及子宫，通过提高卵巢黄体细胞功能和子宫内膜容受性，从而提高胚胎着床率及临床妊娠率;另一方面也可能作用于垂体，使黄体期LH表达升高、PRL表达下降等，从而正向调节生殖轴下游的卵巢及子宫的功能，起到促进胚胎着床的作用。

由于中西医理论体系和表述方式不同，“下丘脑-垂体-卵巢-子宫生殖轴”(HPO轴)与“心(脑)-肾-子宫生殖轴”的说法虽然有差别，但内容基本一致，中西医疗法都是通过调整女性生殖轴、矫正黄体功能，达到临床妊娠目的。

子宫只是靶器官，垂体处于中枢位置，垂体促性腺激素受体(GnRHR)在与来自下丘脑的促性腺激素释放激素(GnRH)结合后，分泌卵泡刺激素(FSH)和LH，LH、FSH是维持黄体功能和卵泡发育不可或缺的性激素［18-19］。据国内外研究表明，GnRH与垂体GnRHR结合后，主要通过三大信号传导系统，PKC-MAPK(蛋白激酶C-丝裂原活化蛋白激酶)、Ca2+-CAM(钙-钙调蛋白)和cAMP-PKC(环磷腺苷-蛋白激酶A)系统，调节和控制LH、FSH的合成和分泌［20-23］。其中PKC-MAPK信号传导通路的PKC是GnRH受体后信号通路中的重要结点，介导MAPK级联放大，包括EPK(细胞外信号调节激酶)、p38MAPK(p38丝裂原活化蛋白激酶)、JNK (jun氨基末端激酶)3条分支，激活下游转录因子，如AP-1(转录激活因子)、E1k1(Ets家族转录因子)、Egr-1(靶分子早期生长反应基因)、CREB (cAMP应答元件结合蛋白)，调控 GTHα、LHβ、FSHβ基因转录［24-26］，cAMP–PKC通路同样激活CREB、Egr-1。此外，GnRH与受体结合后，诱导Ca2+与CAM结合，通过Egr-1、AP-1等转录因子，调节LH、FSH表达。

综合中西医生殖轴的相关理论，周惠芳课题组提出补肾助孕方治疗LPD性不孕症的作用机制假说，即补肾助孕方并非单纯作用于卵巢或子宫单一器官，亦可能直接作用于HPO轴的垂体部位，通过调控GnRHR表达或GnRH受体后PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信号通路(包括信号传导关键分子PKC、SRC、p38MAPK、JNK、ERK1/2、CAM、CAMK2、Calcineurin、cAMP、PKA及重要转录因子AP-1、Elk1、Egr-1、CREB、Nur77)，调节LH、FSH的表达，进而调节卵巢内分泌功能，提高子宫内膜容受性。通过以上各环节的综合作用，达到矫正LPD、促进胚胎着床的目的。

据此，周惠芳团队正着眼于补肾中药对垂体的调节作用研究，立足于GnRH受体后PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信号通路，以米非司酮构建LPD大鼠模型，西曲瑞克构建GnRH受体拮抗细胞模型，从体内外研究补肾中药对GTH表达分泌的调控作用，力求阐明补肾助孕方促进胚胎着床治疗LPD性不孕症的作用机制，为中药治疗LPD不孕症的研究提供新思路、新方法。研究成果不但能为广大不孕症患者带来福音，产生良好的社会和经济效益，同时为“心(脑)－肾－子宫生殖轴”学说、“肾主生殖”理论及“中医女性生殖节律理论”体系提供实验依据。

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Mechanism of BuShenZhuYun Prescriptions on Regnlatrng the Reproductive Axis to Promote Embryo Implantation

DAI Jia-xuan，XU Jian-ya，XIE Tong，JIANG Feng-rong，JIANG Miao，ZHOU Boru，ZHOU Hui-fang△

(Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

BuShenZhuYun recipe is based on the theory of heart(brain)-kidney-uterus axis’which was put forward by professor XIA Guicheng.Clinical studies have confirmed its effectiveness for treating infertility caused by Luteal Phase Defect(LPD)and it also improves the level of P，LH in pre-implantation patients embryos.Experiments suggested that it enhanced the function of ovarian corpus luteum and uterine receptivity.Based on the Chinese and Western medicine consensus of LPD infertility is caused by dysfunction of reproductive axis，we believe that BuShenZhuYun recipe has the effects on pituitary and according to this，we put a new hypothesis that we can use GnRH receptor signal pathway to regulate the expression of GTH with the purpose of adjusting the function of reproductive axis.For the first time we use GnRH receptor PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA signal pathways to study the effects of BuShenZhuYun recipe on expression of GTH excretion and the new mechanism of treating LPD reproductive by kidney-nourishing therapy.It provides new ideas and new methods for curing LPD infertility with Chinese medicine.

BuShenZhuYun recipe;LPD;GTH;GnRH receptor;Signal pathways

R285.5

B

1006-3250(2016)11-1508-03

2016-06-02

国家自然科学基金资助项目(81473713)-补肾助孕方治疗LPD性不孕症的新机制:垂体GnRH受体后信号通路;江苏省自然科学基金资助项目(BK20141463)-补肾助孕方调节垂体GTH表达治疗LPD性不孕的机制;中国和欧洲的医疗保健业发展合作研究计划(China and Europe taking care of healthcare solutions，简称CHETCH，欧盟第七框架玛丽居里行动国际研究人员交流计划资助，FP7/2007-2013/PIRSES-GA-2013-612589);2015年度江苏高校优秀科技创新团队-中医女性生殖节律调节机制与临床研究

戴佳轩(1990-)，女，江苏常州人，医学硕士，从事不孕症的基础与临床研究。

△通讯作者:周惠芳(1962-)，女，教授，博士研究生导师，从事不孕症的基础与临床研究，E-mail:zhouhuifang2011301@ 163.com。