减毒单增李斯特菌载体在肿瘤疫苗中的应用①

贾艳艳 刘莎莎 汪 洋 丁 轲 程相朝 张春杰

(河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，河南省动物疫病与公共安全院士工作站，洛阳471003)

减毒单增李斯特菌载体在肿瘤疫苗中的应用①

贾艳艳 刘莎莎 汪 洋 丁 轲 程相朝 张春杰

(河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，河南省动物疫病与公共安全院士工作站，洛阳471003)

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocyto-genes,LM)是一种宿主谱广泛的兼性胞内菌。LM具有进入抗原提呈细胞(APCs)如巨噬细胞、树突状细胞(Dendritic cell，DC)等细胞胞质的特性，使其运送外源抗原进入MHCⅠ分子和MHCⅡ分子抗原提呈途径，从而诱导强烈的CD8+和CD4+T细胞免疫应答[1]。因此，减毒LM已被公认为是一类理想的肿瘤疫苗载体[2]。

1 生物学特性

LM是一种革兰氏阳性兼性胞内菌，一般通过消化道感染，然后通过肠上皮细胞散播至全身。一部分细菌通过内化素InlA或InlB进入宿主上皮细胞和肝细胞等非吞噬细胞，散在的细菌则被巨噬细胞和吞噬细胞如肝脏的Kupffer细胞所吞噬，在胞内LM通过分泌毒力因子溶血素O(Listeriolysin O，LLO)和磷脂酶C(Phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)降解吞噬体膜进入细胞胞浆中复制，并通过诱导宿主细胞肌动蛋白聚集，在细菌表面形成极化的肌动蛋白尾，促使LM在胞浆内运动并向邻近细胞扩散[3]。

2 LM感染后诱导的免疫应答

2.1 天然免疫应答 LM进入机体后，可以感染肝细胞、巨噬细胞和DC等多种细胞。LM表面有一系列Toll样受体配体(TLR-L)如肽聚糖、脂蛋白、脂磷壁酸及核苷酸结合寡聚区(Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)，能够被细胞表面受体识别，进而释放前炎性因子和趋化因子，并激发一系列的炎症级联反应，发挥天然免疫应答作用[4]。另外，LM还可诱导DC表面共刺激分子(CD40、CD80和CD86)的表达及招募NK细胞至感染部位释放产生IFN-γ，促进APCs的成熟[5]。LM感染产生强烈的天然免疫应答，能直接或间接地促进获得性免疫应答的产生。

2.2 获得性免疫应答 LM感染过程中，溶酶体中的LM被降解为抗原短肽可结合MHCⅡ类分子，从而被CD4+T细胞识别，并诱导CD4+T细胞免疫应答，且该过程释放的Th1型细胞因子如IFN-γ和IL-2等又能辅助CD8+T细胞应答的产生。逃逸至胞浆中的LM释放外源抗原快速进入蛋白降解途径，被降解成抗原肽与MHCⅠ类分子结合形成肽复合物提呈至CD8+T细胞，活化后的CD8+T细胞产生穿孔素、颗粒蛋白酶及IFN-γ等介导细胞免疫应答[6]。除CD4+T细胞和CD8+T效应细胞外，LM还激活非传统的T细胞亚群如γ δ T细胞、NK T细胞发挥免疫保护性效应[7]。因LM可不经过胞外环境完成胞间感染，使其主要以细胞免疫应答为主，这也是LM作为肿瘤疫苗载体的重要优势之一。

3 LM毒力致弱策略

当重组活载体疫苗应用于临床时，安全性显得尤为关键，因此在设计LM载体疫苗时需要在保持免疫原性的同时，降低其致病性。目前主要有4种LM致弱策略：如删除毒力因子、平衡互补系统、营养缺陷株及“Killed but metabolically active”(KBMA)菌株。

在这几种致弱方法中，删除毒力因子是最常采用的方法，不过该方法所面临的挑战是如何在删除毒力因子的同时，仍保留其良好的免疫潜能。LM的毒力基因ActA编码肌动蛋白聚集蛋白(Actin polymerizing protein，ActA)，主要促使LM完成胞间传递，plcB也是LM的重要毒力基因之一[8]。Haroula等[9]构建了LMΔactA/ΔplcB缺失株，研究显示成年志愿者口服LMΔactA/ΔplcB突变株后没有表现出临床病理症状，并且部分志愿者体内产生了特异性免疫应答反应。Ma等[10]构建了表达外源抗原的LMΔactA/ΔinlB突变株，研究表明该减毒重组株在体内毒性显著降低，且仍具有刺激天然免疫应答和诱导特异性T细胞免疫应答的能力，以上这些减毒株都是良好的潜在疫苗载体。

prfA基因是LM基因组中的重要转录调控基因。Wood等[11]构建了prfA平衡互补系统，并将此方法成功应用于多种癌症治疗性疫苗的开发。该方法是将携带目标抗原及PrfA的多拷贝质粒pAM401导入至prfA缺失株，该菌株比野生菌毒力下降约4个数量级，仍保持较好的侵袭能力。

丙氨酸外消旋酶基因(alanine racemase gene，dal)和氨基转移酶基因(αD-amino acid aminotransferase gene，dat)负责LM细胞壁所需D-丙氨酸的合成。Zhao等[12]构建LMΔdal/Δdat营养缺陷株，通过携带消旋酶基因的质粒在IPTG的诱导下供给LMΔdal/Δdat缺失株生存所需的D-丙氨酸，该缺失株在小鼠体内是无毒的，能被机体很快清除，并且保留着CD8+T细胞的效应性功能。

以上致弱细菌方法中，易导致细菌侵袭宿主细胞能力的下降，从而影响其免疫原性。Skoberne等[13]应用一种新方法改造LM为不能复制但仍保持新陈代谢状态(KBMA)。研究显示应用表达外源抗原的KBMA LM菌株免疫小鼠能抵抗病毒入侵和抑制肿瘤生长，且较为安全。

4 重组LM载体肿瘤疫苗的研究进展

1992年，Schafer等[14]首次报道LM运送外源抗原能够诱导机体产生强烈的特异性CD8+T细胞应答。随后，Pan等[15]研究发现表达模式肿瘤抗原的重组LM菌株免疫肿瘤小鼠能引起肉眼可见的肿瘤消退，显示LM载体通过运送肿瘤抗原发挥良好的抗肿瘤作用。从此，LM作为疫苗载体进行癌症免疫预防和治疗研究已成为众多学者的研究方向之一。

当前重组减毒LM疫苗的构建策略有多种。其中最常见的是平衡致死互补系统，即将多拷贝重组质粒pGG-55转化至LMΔprfA，pGG-55携带prfA基因与宿主菌构成互补系统，其携带hly或actA启动子驱动LLO或ActA与外源抗原实现融合表达[16]。其次，采用温敏型质粒pKSV7，利用同源重组技术将目标抗原定点整合至LM基因组，该重组菌不需要抗生素维持，在临床应用方面具有显著优势[17]。还可以利用整合型载体pPL1或pPL2将外源抗原定点整合至LM基因组的非必需区域(comK或tRNA Arg基因片段处)，该方法只需一步，快速便捷，但需抗生素的维持[18]。

4.1 LM载体表达外源肿瘤蛋白抗原的研究 最初，LM主要运送一些模式抗原如β-半乳糖苷酶、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)及流感病毒核蛋白NP[19]进行抗肿瘤研究。重组减毒LM疫苗能够诱导抗原特异性CD8+T细胞介导的CTL应答，从而减慢肿瘤发展进程。

目前，利用减毒LM活载体进行肿瘤疫苗的研究正在如火如荼地进行，其运送的肿瘤抗原包括人乳头瘤病毒HPV16 E7抗原、黑色素瘤抗原Mage-b、高分子量的黑色素瘤相关抗原HMW-MAA、前列腺特异抗原PSA、间皮素mesothelin、抑癌蛋白P53，肝癌抗原等[20-26]。研究显示重组李斯特菌疫苗免疫小鼠均能够诱导特异性CTL应答，在小鼠肿瘤模型中显示良好的抗肿瘤效果，且不产生明显的副作用。

Seavey等[27]利用减毒李斯特菌表达血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2又称fetal liver kinase-1)进行肿瘤血管抑制免疫疗法。其中构建的LM-LLO-Flk1菌株免疫小鼠能够诱导抗肿瘤CTL应答的产生，导致肉眼可见肿瘤的消退，降低残余肿瘤的微血管密度，从而能够保护小鼠抵抗多种肿瘤细胞的攻击及肿瘤转移，显示该重组菌具有广泛的抗肿瘤作用。

由于中枢神经系统是免疫特赦区，因此在治疗中枢神经系统恶性肿瘤面临一些难题如免疫应答较弱等。Prins[28]构建两株重组减毒李斯特菌疫苗即LM-NP(NP396-404)及LM-NP/TRP-2(NP396-404和TRP180-188)，结果表明LM-NP/TRP-2诱导小鼠产生较高的IFN-γ水平及强烈的TRP-2特异性CD8+T细胞应答，通过生物素影像观察免疫小鼠的颅内肿瘤与对照小鼠相比显著减小，并能延长小鼠存活时间。以上这些研究结果为中枢系统肿瘤性疾病的临床免疫治疗带来了福音。

Lori等[29]将LM-LLO-E7已应用于临床实验。试验中选取110名复发性宫颈癌患者接受3个剂量或4个剂量LM-LLO-E7后，12个月存活期患者比例达到36%，18个月存活期比例达22%，11%的患者体内产生了较强的特异性免疫应答，研究显示重组减毒李斯特菌具有很好的应用前景。

4.2 LM载体运送cDNA/mRNA的研究 由于细菌表达抗原属于原核表达，缺乏翻译后修饰及存在classⅡ类T细胞表位的空间构象问题。为此，学者利用LM载体运送cDNA或mRNA，当重组菌进入胞浆后被裂解进而释放质粒，利用宿主细胞进行外源抗原的表达，这种运送方式被称为“bactofe-ction”[30]。该方式比DNA疫苗更有效地诱导免疫应答的产生。证实该方式构建的疫苗免疫小鼠可诱导特异性CD8+T细胞免疫应答的产生，且能够抑制肿瘤生长。但遗憾的是，研究表明这种bactofection方式的免疫效力不如LM疫苗运送蛋白抗原的方式[31]。

4.3 LM自身具有抗肿瘤作用及靶向肿瘤组织 LM对肿瘤组织有特殊的偏好性。Claudia等[32]报道LM能够靶向肿瘤，不仅将肿瘤抗原运送至肿瘤组织，而且通过诱导肿瘤细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平增高引起肿瘤细胞的死亡，证实了LM自身具有抗肿瘤作用，这些研究结果为LM肿瘤疫苗载体的开发提供重要理论基础。

5 载体免疫应答对重组疫苗免疫效果的影响

活载体疫苗研发面临的一个重要问题是体内已存在的载体是否会减弱目标抗原诱发的免疫应答，尤其LM是环境中普遍存在的一类微生物。Starks等[33]研究表明小鼠体内已存在LM抗体不会阻碍重组LM疫苗诱导功能性T细胞的活化、增殖及分化；同时Leong等[34]报道人类体内LM载体免疫应答不会降低重组疫苗诱导的特异性免疫应答。以上研究为重组李斯特菌肿瘤疫苗的临床应用奠定了基础。

6 展望

由于LM的独特胞内生活史及其诱导强烈的MHCⅠ类免疫应答特性，使其作为肿瘤疫苗载体具有众多优势，并在抗肿瘤研究中显示较好的预防性和治疗性效果，但是该载体也存在一些需要优化的地方，如疫苗是否能稳定表达外源抗原以及疫苗的安全性等。因此，在构建重组疫苗时采用什么方法既降低细菌的毒力，同时又能保持其强烈的免疫原性，是研究者重点考虑的问题。我们相信随着研究的不断深入，减毒李斯特菌重组疫苗会得到不断的优化和改进，从而可以更好地应用于肿瘤性疾病的预防和治疗。

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[收稿2016-01-05 修回2016-03-19]

(编辑 许四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.032

①本文受河南省科技攻关计划项目(No.142102110039)、河南省教育厅科学技术研究重点项目(No.14A230005)、河南科技大学博士科研启动基金(No.09001733)、河南科技大学高级别项目培育基金项目(No.2015GJB030)和河南科技大学创新团队资助。

贾艳艳(1983年-)，女，博士，副教授，主要从事分子病原学与免疫学方面的研究，E-mail:jiayanyan0120@163.com。

Q789

A

1000-484X(2016)12-1866-04