猪细小病毒病的诊断与防治研究进展

李 娇，祖立闯，王金良，2，苗立中，2，李 峰，2，沈志强，2（.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）



猪细小病毒病的诊断与防治研究进展

李 娇1，祖立闯1，王金良1，2，苗立中1，2，李 峰1，2，沈志强1，2
（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

摘 要：猪细小病毒是可以感染母猪和仔猪的一种病毒性传染病，该病毒可以引起母猪的繁殖障碍，流产和产死胎及木乃伊胎，仔猪腹泻和皮炎。该病毒在猪场经常发生感染，给养猪业带来严重的经济损失。通过综述猪细小病毒的临床诊断和分子生物学诊断及防治研究进展，旨在为疾病的预防和控制提供参考。

关键词：猪细小病毒病；诊断；防治；研究进展

猪细小病毒(PPV)属于细小病毒科细小病毒属，为单股正链DNA病毒，猪细小病毒病发病率和感染率都很高，污染的饲料，饮水，食物都可以传播病毒[1]。该病的发生季节性不明显，一般每年的夏、春、秋三季都易感染发病[2]。该病的诊断包括临床诊断和分子生物学诊断，该病的防治措施建议以疫苗免疫和加强饲养管理为主，现将猪细小病毒病的诊断与防制方法简要介绍如下。

1　 临床初步诊断

猪细小病毒感染可以引起母猪不孕，产死胎及木乃伊胎，怀孕母猪表现为不明原因流产，死胎有皮下出血及水肿，胸腹腔有黄色渗出液，肝脾肾肿大。仔猪表现皮炎和腹泻。

2　 常规实验室检测方法

常规的实验室检测方法包括免疫荧光、病毒分离、血凝抑制实验等。

2.1免疫荧光

免疫荧光是很直接和特异的猪细小病毒检测方法，将猪细小病毒的组织病料1∶3比例加入灭菌生理盐水，用研磨器研磨成组织匀浆，反复冻融3次，12 000 r/min离心取上清液，用滤器过滤除菌，取少量病毒滤液加到PK-15细胞培养瓶中，培养过程中观察细胞病变，及时更换细胞液，培养6 d左右，将细胞反复冻融3次，离心取细胞上清液，取少量上清液再次接种PK-15细胞培养瓶，同样方法盲传3代，培养2～3 d进行病毒直接免疫荧光抗体实验。通过镜检观察，出现猪细小病毒特异性荧光的为阳性，否则为阴性。该方法特异性强，敏感性高，但实验周期较长，不适合快速诊断。

2.2病毒分离

病毒分离是疾病诊断过程中很重要的一种方法，病毒处理过程同上，通过接种细胞，观察病变特征等进行疾病诊断，该方法同样实验周期长，但在疾病的诊断过程中发挥很重要的作用。国内刘秀芬等[3]利用ST细胞培养，分离到一株猪细小病毒，该病毒通过在ST-细胞上盲传6代开始出现细胞病变，呈现圆缩、融合、拉网等明显有规律的细胞病变，盲传到12代开始对豚鼠红细胞有血凝作用，该研究为猪细小病毒的分离提供参考。Wu R等[4]分离到一株新型猪细小病毒，该病毒从临床送检的猪肺组织中检出，通过对病毒基因组的测序和序列分析，证明该毒株与现有的猪细小病毒处于不同分支，该新型猪细小病毒的分子流行病学调查有待深入研究。

2.3血凝抑制实验

由于猪细小病毒具有血凝性，可以凝集人O型血和豚鼠红细胞，利用病毒的这一特性可以进行血凝抑制实验来进行疾病诊断。通过特异性的猪细小病毒阳性血清与猪细小病毒中和而产生血凝抑制，该方法敏感性不高，不能作为疾病诊断的唯一方法，可以在疾病的诊断过程中提供参考。

3　分子生物学诊断方法

猪细小病毒的分子生物学诊断方法包括常规的PCR检测方法，荧光定量PCR检测方法，LAMP检测方法，现简要介绍如下。

3.1PCR检测方法

PCR检测方法是猪细小病毒检测最常用的方法，但普通的PCR检测方法敏感性不显著，国内崔宇超等[5]建立了猪细小病毒的高效纳米PCR检测方法，该检测方法比普通的PCR检测方法敏感性提高1000倍，最低核酸检出量为4拷贝/μL，利用该检测方法检测其他猪病毒核酸，检测结果均为阴性，说明该检测方法有很好的特异性，分别采用纳米PCR和普通PCR对3个省份送检的43份临床样品检测，PPV阳性率分别为95 %和72 %，说明纳米PCR检测方法有更高的敏感性，更适合PPV低含量临床样品的检测。

3.2荧光定量PCR检测方法

荧光定量PCR检测方法具有很高的敏感性，但所需的仪器设备及检测试剂均较贵，一般用于病毒的精确定量研究。刘崇灵等[6]建立了猪细小病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法，检测不同接毒条件对病毒增殖效果的影响。结果表明，ST细胞覆盖率接近单层时接毒，采用分步接毒法，接种病毒后感作2 h，接毒后细胞维持液中血清浓度设为2 %可以提高PPV细胞培养的病毒滴度。邓兰兰等[7]建立了猪细小病毒与猪伪狂犬病毒(PRV)的二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，对猪细小病毒和猪伪狂犬病毒检测的灵敏度分别达到248拷贝/μL和160拷贝/μL，是普通PCR检测方法的100倍，实现了两种病毒的同时检测，能够对PRV和PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。Gava D等[8]建立了新型猪细小病毒(PPV4)的实时荧光定量PCR检测方法，选取PPV4保守的ORF3基因设计检测引物，该荧光PCR检测方法最低可以检出9.5X10拷贝DNA/μL，与其他的猪病毒没有交叉反应，有很好特异性，用该检测方法检测272份样品，阳性率为13.2%，比普通PCR方法敏感10倍，该荧光PCR检测方法可以作为新型猪细小病毒的临床样品检测方法，用于猪群的流行病学调查。

3.3LAMP检测方法

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种恒温核酸扩增技术，该技术具有特异性高，敏感性好，操作简单，反应快速，成本低廉等优点，结果判定直接用肉眼观察，比较直观。陈星瑶等[9]建立了猪细小病毒的LAMP检测方法，针对猪细小病毒的VP2基因设计特异性检测引物，通过反应条件的优化，最终确定LAMP反应温度可以选择60 ℃、62 ℃、64 ℃、66 ℃中任一温度，LAMP反应的扩增时间为45 min，在60 ℃反应条件下45 min最低可以检出10个拷贝的模板，与其他猪病病毒没有交叉反应，有很好的特异性。猪细小病毒LAMP检测方法为猪细小病毒的诊断提供了一种简单、快速、敏感、便捷的检测方法，适用于猪细小病毒的临床检测，具有良好的应用前景。

4　 防治

猪细小病毒的综合防控以预防措施为主，包括定期消毒和疫苗免疫接种，做好养殖场环境卫生，加强饲养管理等。

4.1疫苗免疫接种

猪细小病毒的疫苗有很多种，包括灭活疫苗，基因工程亚单位疫苗，基因工程活载体疫苗等。各种疫苗各有优缺点，按照各自的免疫要求及时免疫接种，一般都能起到免疫保护作用。确保疫苗的质量，应使用兽医主管部门推荐或国家定点专业生物制品厂生产的疫苗，疫苗的运输、保存和使用均应在低温条件进行，严防日晒和高温。注射部位应消毒，注射要确实，严禁用大号、短针头注射和打飞针，避免注射部位过浅和剂量不足，不能漏注少注。定期进行血清学抗体监测、排除母源抗体干扰，随时掌握猪群的免疫抗体水平，依据抗体监测结果制定科学合理的免疫程序并不断调整，使猪群有整齐、保持高效价的抗体水平。

4.2加强饲养管理和环境卫生

良好的环境卫生是防止猪细小病毒病暴发的前提条件，及时清理猪舍中粪便、污水，定期做好圈舍消毒，且应经常更换或交替使用消毒药物，避免产生耐药性。饲料要合理搭配，配制全价平衡日粮，可配合应用一些中草药饲料添加剂也具有抗菌抗病毒的作用，禁止饲喂霉变饲料。饮水要保持新鲜、清洁。建立档案管理制度，对每头种猪、每一批仔猪从出生到出售均应独立建档，并作好记录，归档保存。

5　 结语

猪细小病毒病的诊断与防治是一项综合性的系统工程，随着我国规模化养殖的快速发展，动物疫病多种病原的混合感染与继发感染日益严重，给兽医临床诊断增加了难度，对于猪细小病毒病的诊断，笔者建议应结合自身实验室的试验条件与优势选择一种或二种实验室诊断方法对临床疑似病例进行确诊。对于猪细小病毒病的防治，笔者建议应采取加强饲养管理和环境卫生，确保疫苗免疫效果为主的预防措施。总之，猪细小病毒病的诊断与防治中，只有采取早预防、早发现、早确诊、早治疗、早淘汰的综合性诊治方法，才能逐步实现猪细小病毒病净化，提高养猪生产经济效益。

参考文献

[1]殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：681-688.

[2]许英民.猪细小病毒流行特点及其防制措施[J].兽医导刊，2015 (5)：57-58.

[3]刘秀芬，姜艳平，唐丽杰，等.猪细小病毒HLJ-DN株分离鉴定[J].东北农业大学学报，2014，45(6)：74-78.

[4]WU R，WEN Y，HUANG X，et al.First complete genomic characterization of a porcine parvovirus 5 isolate from China[J].Arch Virol，2014，159(6)：1533-1536.

[5]崔宇超，彭永刚，马兴杰，等.猪细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014，36(4)：286-288.

[6]刘崇灵，刘晓波，胡呈才，等.猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测不同接毒条件对病毒增殖效果的影响[J].湖南畜牧兽医，2014(3)：7-9.

[7]邓兰兰，金钺，李明凤，等.猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR Green I实时荧光PCR方法的建立与检测[J].中国兽医学报，2014，34(5)：690-694.

[8]Gava D，Souza C K，Schaefer R A，et al.TaqMan-based real-time PCR for detection and quantification of porcine parvovirus 4[J].J Virol Methods，2015，219(7)：14-17.

[9]陈星瑶，张子群，王晓龙.猪细小病毒LAMP检测方法的建立[J].中国动物保健，2014，16(8)：9-12.

(收稿日期：2015-07-30)

作者简介：李娇，女，辽宁人，硕士，助理研究员，主要从事动物疫病诊断及疫苗研究

基金项目：山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）