胚胎植入前遗传学诊断和筛查的研究进展

刘茜桐，田　莉，师娟子

(西北妇女儿童医院，陕西 西安 710000)



【女性生殖医学研究】

胚胎植入前遗传学诊断和筛查的研究进展

刘茜桐，田莉，师娟子

(西北妇女儿童医院，陕西 西安 710000)

胚胎植入前遗传学诊断(PGD)和筛查(PGS)是近年来发展的植入前遗传学检测(PGT)方法。PGD主要适用于父母携带基因突变或染色体平衡易位，通过体外受精，在胚胎移植前检测特定的突变以及非平衡染色体异常是否传递到卵子或胚胎。PGS是运用相同的检测方法检测胚胎染色体非整倍性，通过移植正常的胚胎从而提高妊娠率。PGD/PGS相关检测技术发展日新月异，传统FISH技术逐渐被取代，更多的新技术也在研发中。但是，PGD/PGS仍存在费用昂贵,无法检测所有胚胎异常等不足之处。该文综述PGD/PGS相关进展和PGD/PGS所存在的问题。

植入前；遗传学筛查；遗传学诊断；非整倍体

[Abstract]Preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)andpreimplantationgeneticscreening(PGS)arerecentlydevelopedpreimplantationgenetictesting(PGT).PGDisappliedwhenoneorbothgeneticparentscarryagenemutationorabalancedchromosomalrearrangementandtestingisperformedtodeterminewhetherthatspecificmutationoranunbalancedchromosomalcomplementhasbeentransmittedtotheoocyteorembryo.PGSusesthesamemethodfordetectingembryochromosomalaneuploidyinordertoimprovepregnancyrate.WiththedevelopmentofnewtechnologyrelatedwithPGD/PGS,FISHisgraduallybeingreplacedandnewmethodsareunderresearch.However,PGD/PGSisexpensiveandcannotdetectallabnormalitiesoftheembryo.ThisarticlereviewedtheadvancementandshortcomingsofPGD/PGS.

[Keywords]preimplantation;preimplantationgeneticdiagnosis(PGD);preimplantationgeneticscreening(PGS);aneuploidy

胚胎植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)是通过体外受精或胞质内单精子注射获得胚胎，利用分子生物学技术对胚胎进行检测，以获得无遗传疾病的胚胎进行移植，从而避免患儿出生以及反复人流或引产导致的生理和精神创伤[1]。胚胎植入前非整倍体筛查(preimplantationgeneticscreeningforaneuploidy,PGS)可在胚胎移植前对胚胎染色体结构和数量进行检测和筛查，通过比对，分析胚胎是否有遗传物质异常。

1989年Handyside首次将PGD技术应用于临床，如今，PGD已在全球范围内被广泛应用。PGD将产前诊断提前到胚胎种植之前，避免了异常妊娠的发生。PGD主要适用于夫妇一方染色体异常，单基因病，性连锁疾病，非整倍体筛查等。PGS在最初的指南中，被称为“低风险PGD”。PGS适用于女方高龄，染色体正常的夫妇出现复发性流产、反复种植失败、严重的男方不孕患者[2]。ESHRE3统计了10年的PGD数据，该数据纳入62个中心共5 780个取卵周期，PGS占2 979个周期，单基因疾病占1 574个周期，染色体异常占1 071个周期，X性染色体连锁疾病占108个周期，社会性别选择占48个周期。

1适用范围

1.1染色体异常

一般人群中染色体异常发生率为5/1 000。染色体异常包括染色体数目异常和结构异常。克氏症(47，XXY)和Turner综合征(45，XO)都是染色体数目异常。染色体结构异常包括相互易位，罗氏易位，倒位。染色体易位是染色体结构异常中最常见的类型，平衡异位的发生率约为1/500，对于自然流产或者有不良孕产史的患者出现染色体平衡易位的概率升高，约为2%。IVF助孕中复发性流产和胚胎反复种植失败的患者染色体异常发生率为5%。染色体相互易位在因染色体结构异常行PGD人群中占60%。相互易位患者中男女数量比例接近，罗氏易位患者中男性数量约为女性的2倍[3]。

PGD技术可以避免染色体异常的胚胎植入子宫导致妊娠失败或者新生儿缺陷。3篇RCT研究报道在年轻，预后好的患者中，PGD-A(非整倍体筛查)比单纯形态学筛选胚胎有更高的妊娠率[4]。

1.2单基因病

单基因病指单个基因突变引起的疾病，遵循孟德尔定律。包括以下几种：①常染色体显性遗传，常见疾病有Huntington病、强直性肌营养不良等；②常染色体隐形遗传，常见疾病有肝豆状核变形、脊肌萎缩症等；③X连锁显性遗传，常见疾病有抗维生素D佝偻病、色素失禁症等；④X连锁隐形遗传，常见疾病有假肥大型肌营养不良、血友病A、B等；⑤Y连锁遗传，常见疾病有外耳道多毛症。目前已有超过150种单基因疾病通过PGD技术检测。

1.3反复胚胎种植失败

反复胚胎种植失败(repeatedimplantationfailure,RIF)指连续经历3次以上移植优质胚胎仍未获临床妊娠[5]。反复胚胎种植失败患者，其胚胎染色体异常比例较高。虽然辅助生殖技术不断发展，但是IVF种植率仍然只有40%～60%。现有的胚胎评级标准例如胚胎形态学评分对胚胎发育潜能预测价值有限。因此，我们需要更客观的评价标准来选择胚胎。PGD可以在胚胎植入前对其分析是否携带遗传性疾病，是否为非整倍体胚胎。

1.4复发性流产

复发性流产(recurrentspontaneousabortion,RSA)是指连续发生2次或2次以上超声或病理检查证实的胎儿丢失[6]。细胞有丝分裂和减数分裂都可能产生非整倍体。辅助生殖技术中早期流产率为10%～20%[7]。自然流产组织中50%～70%有细胞遗传学异常，最常见的核型是常染色体三体。随着年龄增大，染色体异常在流产患者中占到的比例增大。高龄女性胚胎染色体发生异常的几率增加。并且，非整倍体是导致种植失败、流产、胎儿先天畸形的主要原因。异常染色体常出现在16,22号染色体。PGS与期待治疗相比，花费高，活产率低，但是临床流产率低[8]。

PGD还可应用于HLA配型、迟发型疾病，肿瘤倾向，遗传性心脏病，早发型阿尔兹海默症等。

对于已生育患儿的家庭，通过PGD可得到相同人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)类型的胎儿，并通过新生儿脐血造血干细胞移植治疗第1个患儿。2000年，PGD的指征增加了HLA配型。 需要相匹配的造血干细胞的家庭，例如子女患疾病(白血病、再生障碍性贫血等)均可以行PGD-HLA(preimplantaiongeneticdiagnosis-humanleukocyteantigen,PGD-HLA)。

建议的PGD-HLA临床指南[9]：①没有相匹配的HLA捐赠者；②造血干细胞移植(haematopoieticstemcelltransplantation,HSCT)需求不紧急，可等待至少9～12个月(invitrofertilization-preimplantaiongeneticdiagnosis,IVF-PGD)至少需要2～3个月，考虑到妊娠至分娩，至少需要1年才能获得HSCT)；③女方在育龄期或者有配型相符的供卵者；④即使疾病预后良好，在疾病诊断后数周内应向家庭告知PGD-HLA；⑤如果当地没有进行PGD-HLA条件，应该和其他中心合作完成。

2胚胎活检技术比较

2.1极体活检

极体为卵母细胞减数分裂产物，无明显生物学作用，对胚胎后续发育影响极小，取材方便，活检时间早，有充足时间进行基因诊断，易于接受。极体活检的缺点在于遗传性诊断范围局限，不能检测父源性基因或染色体组成，需要连续活检第一极体和第二极体，极体体积很小容易降解，因此应用较少。

2.2卵裂球活检

一般认为卵裂期胚胎是全能的，取1个细胞活检不影响胚胎发育。卵裂球活检后可以新鲜移植胚胎，是PGD活检的主要方法，大约占报道PGD周期的90%。其缺点在于取材少，卵裂期胚胎染色体异常比例大[10]，胚胎存在嵌合体可导致误诊。胚胎在发育过程中，可能存在自我矫正机制。卵裂球活检可能造成正常胚胎浪费。

2.3囊胚活检

近年来，随着玻璃化冷冻技术的开展，囊胚活检逐渐成为趋势。囊胚活检可从滋养外胚层活检10个细胞，准确性增加，有助于诊断嵌合体，移植胚胎着床率高。由于遗传学诊断所需时间导致囊胚需冷冻移植，冷冻解冻过程可能造成囊胚损伤，体外培养时间的延长可能导致遗传印记疾病发生。D6新鲜移植在高龄女性中妊娠率显著降低。

3诊断技术

过去的20年间，胚胎种植前遗传检测主要通过PCR或FISH技术进行胚胎筛选，近年来，出现了很多新兴的遗传检测方法，使得同时检测23条染色体成为可能。

3.1聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)主要用于单基因病的诊断，缺点在于费时，每一对夫妻或遗传疾病都需要制定一套方案，且取材少，可能出现模板量少，扩增效率低，被污染，等位基因脱扣(alleledrop-out,ADO)。

3.2荧光原位杂交

荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是最早应用于PGD/PGS的分子技术。FISH根据被检测基因设计特异寡核苷酸探针，进行荧光标记后与染色体或间期核杂交，通过在荧光显微镜下观察荧光以筛查染色体异常。

FISH探针稳定性好，技术简单，时间短，重复性好，可以检测出染色体异常和鉴别性别，缺点在于由于探针数量限制，检测的染色体数目少。倒位和罗氏易位患者进行FISH-PGD可以提高IVF成功率[11]。9项随机对照试验显示FISH-PGS不能提高IVF的活产率[12]。

3.3比较基因组杂交技术

比较基因组杂交技术(comparativegenomichybridization,CGH)技术是在FISH技术基础上发展起来一种新的分子细胞遗传学技术。CGH利用不同颜色的非同位素荧光标记待测细胞DNA与正常基因组DNA，两者混合后制备成探针，通过与正常人外周血白细胞的有丝分裂中期染色体原位抑制杂交，再分别进行检测，通过比较两种荧光探针荧光信号强度差异，判断遗传物质的缺失与重复。CGH检测周期短，效率高，但诊断昂贵、技术要求高、耗时(需要72小时)，不能区分非整倍体异常和染色体平衡易位携带。

3.4微阵列-比较基因组杂交

微阵列-比较基因组杂交(array-basedcomparativegenomichybridization,aCGH)又称arrayCGH，是一种将基因芯片和CGH相结合的新技术。将待检测细胞DNA与基因组DNA用荧光标记后和基因芯片进行杂交。具有高通量，高分辨率，高灵敏度，快速，自动化，但是不能检出所有的染色体异常，例如染色体倒位。

3.5单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP分布于整个基因组，具有很好的遗传稳定性。2010年，SNP芯片首次用于PGS。SNP芯片原理在于针对等位基因设计探针，用化学荧光标记待检DNA后与探针杂交，根据荧光强弱判断被检序列的变异。某些SNP可能与疾病发生有关。SNP最大的优越性在于可以同时做每个胚胎的DNA指纹分析。

SNP易于自动化分析，分辨率高，准确性高，可发现微小的非平衡染色体的缺失、重复和易位，但是费用昂贵，无法完全区分正常和平衡易位携带者的胚胎。在单细胞水平，SNP芯片技术检出率显著高于传统FISH技术。同一胚胎不同单卵裂球间，SNP芯片结果一致性显著高于FISH[13]。与FISH-PGD相比较，SNP-PGD怀孕率高，流产率低[14]。

3.6全基因组扩增技术

全基因组扩增技术(wholegenomeamplification,WGA)不能直接进行染色体分析，是将单细胞中全基因组单拷贝DNA由pg级别扩增到μg级别，为下游高通量遗传检测提供充足样本，以实现微量DNA多基因位点分析和重复检测。具有快速、高效、准确性高的特点。

3.7高通量测序

高通量测序又称新一代测序技术(nextgenerationsequencing,NGS)。可在数百万个位点上同时进行阅读测序，定量，能有效监测差异性中等或较小的基因，敏感度和特异度高。

3.8单细胞基因组测序

单细胞基因组测序可以发现更微小的染色体缺失和重复，并且可以一次检验更多标本。能够同时进行染色体异常、单基因疾病、线粒体异常的诊断。具有成本低、速度快的优点。基因组测序的深度影响结果，如果测序深，将导致信息量大，胚胎筛选困难，如果测序浅，则可能造成漏诊。如今，全面染色体筛查(comprehensivechromosomescreening,CCS)也运用于临床。CCS可以运用多种基因检测方法(CGH、aCGH、SNP、qPCR、NGS)，在胚胎不同时期(极体、卵裂期和囊胚期)分析所有染色体成分，提高种植率[15-16]。Karyomapping是改良的SNP检测技术，主要用于单基因病，通过对比父母和家庭成员的染色体片段，筛选出不携带致病基因的胚胎进行移植，但是难以检测新发突变。

4安全性

多篇文献报道IVF出生的孩子社会心理发展与自然妊娠孩子没有差异[17-19]。PGD涉及单精子注射及胚胎活检的侵入性操作，并且进行PGD助孕的夫妻可能自身患有某些遗传性疾病、家庭成员死亡，或者经历了多次流产，这些压力和情绪都可能影响PGD出生的孩子心理健康。

据统计，PGD妊娠后剖宫产率高，早产率高，低出生体重儿多，但PGD孩子认知能力与自然妊娠孩子相比无差异[20]。一项前瞻性病例对照研究提出PGD出生的孩子在心理发展上与自然妊娠出生的孩子没有区别[21]，但仍需要大样本长期随访证实PGD的安全性。

5局限性

PGD/PGS活检属于有创操作，对胚胎有一定程度的损伤。多数中心采用卵裂期活检，卵裂期胚胎染色体异常和嵌合发生率高，活检细胞能否能代表胎儿发育尚不十分明确。PGD/PGS可能需要冷冻胚胎，反复冻融胚胎可能降低胚胎存活率。PGS仅能对胚胎进行整倍体筛查，但是不能改善胚胎质量或者增加可用胚胎数量。PGD/PGS可能导致IVF无可移植胚胎，并且费用昂贵，不能检测所有遗传缺陷，可能导致结局不良。PGD/PGS妊娠后，仍需产前诊断。很多疾病病因不清或是由多基因共同导致的，尤其是新发突变，这是PGS的盲区。目前对PGS安全性的评估需要多中心、大样本随访。

当一项技术应用于临床时，必须有科学证据证明对患者有益。但是尚没有足够证据表明PGS可以提高IVF活产率。可以明确的是，PGS可以降低流产风险，但是活产率、备孕时间与自然妊娠没有显著差异[22]。胚胎嵌合的可纠正性，遗传学检测导致正常胚胎浪费，较高的费用使PGS的应用尚未完全推广。对于IVF预后差的患者，PGS检测非整倍体不能增加甚至会降低持续妊娠率和活产率。2004年以来，有11个针对高龄女性的FISH-PGS-RCT，提示高龄女性不能从中受益。因此，在进行PGD前，应对患者进行遗传咨询，充分告知利弊。随着PGD/PGS广泛应用于临床，如何提高其活产率、降低误诊率、减少费用、检测更少量的细胞成为将来优生优育的发展方向。随着囊胚活检的推广和新的检测技术的应用，PGS的应用价值需要进一步临床研究证实。

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[专业责任编辑：王兴玲]

Research progression on preimplantation genetic diagnosis and screening

LIU Xi-tong, TIAN Li, SHI Juan-zi

(Northwest Women’s and Children’s Hospital, Shaanxi Xi’an 710000, China)

2015-12-26

刘茜桐(1989-)，女，住院医师，硕士，主要从事辅助生殖诊治工作。

师娟子，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.01.042

R715.5

A

1673-5293(2016)01-0123-04