枯草芽孢杆菌8-32拮抗菌株的紫外诱变选育

高同国，贾天瑶，郭晓军，张冬冬，朱宝成

(河北农业大学 生命科学学院，河北 保定　071001)



枯草芽孢杆菌8-32拮抗菌株的紫外诱变选育

高同国，贾天瑶，郭晓军，张冬冬，朱宝成

(河北农业大学 生命科学学院，河北 保定071001)

摘要：为了获得更高拮抗活性的菌株，以对大豆根腐病病原菌具有较强拮抗作用的Bacillus subtilis 8-32为实验材料，采用紫外线诱变方法选育具有更高拮抗活性菌株.紫外诱变条件为30 W紫外线，15 cm辐射距离，诱变时间4 min.结果表明，经初筛和复筛，从诱变后菌落形态差异显著的100个菌株中，筛选得到3株(YB-1，YB-2和YB-3)拮抗活性明显增强的菌株，其拮抗活性与对照相比分别提高了50%，55%和50%，并且传代培养10次后其活性保持不变，说明诱变菌株YB-1，YB-2和YB-3遗传性状稳定.

关键词：大豆根腐病；枯草芽孢杆菌；尖孢镰刀菌；紫外诱变

第一作者：高同国(1984-)，男，河北邢台人，河北农业大学讲师，博士，主要从事植物真菌病害及生物防治研究.

E-mail：gtgrxf@163.com

大豆是世界上重要的粮食及经济作物，近些年由于重茬、迎茬比例不断增加，大豆根腐病日趋严重，成为制约大豆生产的主要病害之一.仅黑龙江垦区大豆根腐病发病率就为75%~90%，感病品种产量损失为5%~10%，严重可达90%以上，有的甚至绝产[1]，给我国经济带来严重损失.

大豆根腐病(soybean root rot)是大豆根部和茎部疾病的统称[2]，是一种根治困难、危害严重的常发性土传病害.大豆根腐病在整个生长期都有可能发生，病原菌通过浸染植株的根、茎、叶以及部分豆荚，引起根和茎的腐烂、植株矮化、枯萎,最终导致大豆死亡.大豆根腐病的致病菌有多种，其中以尖孢镰刀菌为主要致病菌[3].目前，对大豆根腐病的治疗主要依靠化学农药，但化学农药的使用造成严重的环境污染，所以生物防治土传染疾病逐渐引起大家的关注[4],并且由于细菌自身的优点，在生物防治中展现出良好的发展前景，因此，用生物来防治疾病的研究与开发有着重要的意义[5-7].

目前用于生物防治的菌株中研究最多的是芽孢杆菌属(Bacillussp.)和假单胞菌属(pseudomonassp.)，芽孢杆菌可以产生内生芽孢，抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，易定殖在植物表面，其逐渐成为世界上生防细菌研究的重点.如Zhang等[8]采用拌种和根施2种方法研究了10株枯草芽孢杆菌在防治镰刀菌引起的根腐病上的效果，其中4株细菌对根腐病的防治效果达到43%~63%.芽孢杆菌BH1对尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病的田间防效达56.1%，大豆增产7.6%[9-10]；细菌 BRF-1可促进大豆幼苗生长，在豆长连、重1年和正茬土壤上，对大豆根腐病的防治效果分别达 53.9%,34.4%和 15.8%[11].上述研究均表明芽孢杆菌可以有效地防治大豆根腐病的发生，目前可用于大豆根腐病的商业菌剂中的菌种以枯草芽孢杆菌为主，如Bio safe，Companion，HiStick N/T等[12]，但这些产品主要集中在美国等发达国家，国内对大豆根腐病的防治虽然取得了一定的进展，但是有效的商业化菌剂依然很少.

在前期工作中，以大豆根腐病病原菌——尖孢镰刀菌为指示菌，从实验室保存的237株细菌中筛选得到1株对尖孢镰刀菌具有明显拮抗作用的菌株Bacillussubtilis8-32，平板对峙实验表明其抑菌圈直径达21.62 mm，孢子萌发抑制率达42.5%~71.6%，温室生防效果显示该菌株使大豆根腐病病情指数降低了32.08%.为进一步提高其拮抗能力，本实验拟通过对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)8-32进行紫外诱变，筛选出具有更强拮抗性能的菌株，为8-32菌剂的开发及大豆根腐病的防治奠定基础.

1材料与方法

1.1　材料

生防细菌：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis8-32(本实验室筛选保藏).

大豆根腐病病原真菌：尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)(由中国科学院东北地理与农业生态研究院王光华教授提供).

1.2　方法

1.2.1菌种活化

尖孢镰刀菌的活化：取保存好的尖孢镰刀菌斜面1支，挑取1块菌落接种在PDA培养基平板上，倒置放在28 ℃的培养箱中培养，培养3~5 d.

枯草芽孢杆菌的活化：取实验室保存好的枯草芽孢杆菌斜面1支，用划线的方法接种在NA培养基平板上，倒置放在37 ℃的培养箱中培养，培养1~2 d.

1.2.2枯草芽孢杆菌8-32生长曲线的测定

用竹签挑取活化好的枯草芽孢杆菌，接种到NB培养基中，37 ℃，180 r/min震荡培养12 h.再按1%的接种量接种到新鲜的NB培养基中，37 ℃，180 r/min震荡培养，并每隔2 h取样，测定样品在600 nm波长下的吸光度，并绘制生长曲线[13-14].

1.2.3紫外诱变方法

参考文献紫外诱变方法根据[15]，具体步骤如下：将活化好的8-32菌种接种于NB培养基中，置于37 ℃，180 r/min的摇床上震荡培养7 h.将培养好的菌液离心，4 000 r/min，15 min收集菌体，并用生理盐水洗涤2次，调整细胞浓度为108~109/mL，待用.将制作好的菌悬液倒入平皿中(加液量为15 mL左右)，加入转子，放置在磁力搅拌器上与紫外灯(30 W)相距15 cm处，分别照射0，1，2，4 min.在红灯下对诱变后的菌悬液进行梯度稀释，并选择合适的梯度涂布平板，涂好后放入37 ℃黑暗培养箱中倒置培养24 h.对培养后的平板计数，并计算菌体的存活率.

1.2.4检测平板的制备

将约20 mL灭菌PDA培养基倒入培养皿中，作为底层培养基.取5 mL无菌水倒入病原菌活化平板并用接种针刮取孢子制成菌悬液，将菌悬液倒入45 ℃左右的灭菌PDA培养基，混匀铺板，作为上层培养基,待平板冷却后制成含有病原菌的PDA检测平板.

1.2.5枯草芽孢杆菌的诱变及筛选

根据致死率曲线选择致死率为80%~90%的诱变时间对枯草芽孢杆菌进行诱变，步骤同1.2.3.挑取紫外诱变后形态特征不同的枯草芽孢杆菌单菌落，用十字划线的方法接种在尖孢镰刀菌鉴定平板上，进行初筛.将平板倒置放在28 ℃的培养箱中培养48~72 h，观察并挑选出抑菌圈比较大的单菌落进行复筛.采用琼脂扩散抑菌圈法对初筛后抑菌圈比较大的菌体进行复筛.首先对初筛后的菌体进行液体发酵培养24 h，然后将发酵液4 000 r/min离心20 min，取上清液加入所打的孔中，放在28 ℃的培养箱中培养48~72 h，观察并测量抑菌圈的直径，计算抑菌圈增长率.

1.2.6遗传稳定性测定

将复筛后抑菌圈比较大的菌株(YB-1，YB-2，YB-3)进行传代培养，用竹签挑取经过复筛后抑菌圈比较明显的单菌落，用划线的方法接种在NA培养基平板上，培养24 h，重复10次，即完成传代培养10代.对传代培养10代以后的菌株发酵培养24 h，采用琼脂扩散抑菌法观察抑菌圈的变化情况，同时与出发菌株的抑菌圈进行比较，分析此菌株的稳定性.

2结果与分析

2.1　生长曲线的绘制

本实验采用分光光度法对枯草芽孢杆菌8-32的生长曲线进行测定，结果见图1.结果显示：0~2 h菌体处于调整期，2~20 h菌体处于对数期，20~90 h菌体处于稳定期；90 h以后菌体死亡速率大于生长速率，菌体处于衰亡期.本实验选取对数期的菌体进行研究，选择生长7 h(对数生长初期)的菌体作为研究对象.

图1　8-32的生长曲线

2.2　诱变后菌体存活率

根据生长曲线，对培养7 h的菌体进行紫外诱变，在30 W紫外灯，辐射距离15 cm条件下，以NA为培养基，采用梯度稀释涂布平板方法，研究不同辐射时间对8-32菌体存活数量的影响，结果见图2和图3.由图2可知，随着紫外照射时间的延长菌体的存活率越来越低.通过对图2平皿上的菌体计数，计算出不同诱变时间下菌体的存活数量，绘制存活率曲线.由图3可知，当诱变时间为1 min时，其存活率为66.40%，2 min的存活率为26.60%，4 min的存活率为17.5%.

2.3　初筛结果

对诱变处理4 min，避光培养24 h后形态不同的菌体进行筛选.通过对100个形态不同的菌株进行筛选，得到3株抑菌效果较强的菌株，筛选结果如图4.结果显示：与对照菌相比较，YB-1,YB-2和YB-3的抑菌效果都有所增加，将这3株菌进行保藏并对其复筛，进一步研究其抑菌作用.

图2　紫外诱变不同时间后8-32菌体存活数量

图3　紫外诱变不同时间8-32菌体存活率变化曲线

图4　诱变后初筛结果

2.4　复筛结果

采用琼脂扩散抑菌圈法对初筛得到的3株抑菌活性较高的菌株(YB-1，YB-2，YB-3)进行复筛，结果见图5.结果表明，诱变后得到的3株细菌YB-1,YB-2和YB-3的抑菌圈直径与对照菌相比较都有明显的增大.与对照菌相比较，YB-1，YB-2和YB-3抑菌圈的平均直径分别增加了50%，55%和50%.

图5　复筛结果

2.5　遗传稳定性检测

对复筛得到的3株抑菌活性较高的菌株进行连续传代培养， YB-1，YB-2和YB-3连续传10代后分别标记为YB-1-C，YB-2-C和YB-3-C.采用琼脂扩散抑菌圈法对传代后的菌株进行稳定检测(图6)，结果显示经过传代培养10代以后，抑菌圈大小未有明显改变，说明本实验筛选得到的3株菌株的高产性状可以稳定遗传.

图6　诱变菌株遗传稳定性检测

3讨论

大豆根腐病是引起大豆减产的主要原因之一，生物防治因其高效、安全、无污染等优点越来越引起人们的重视.采用紫外线进行诱变育种是生防菌株常用的育种方法之一，如王静等[16]对枯草芽孢杆菌 B47进行了2次紫外诱变选育，诱变后其菌株对西瓜枯萎病病菌的拮抗能力提高37.5%~68.8%，贾洁等[17]采用紫外诱变后其菌株对大肠杆菌的抗菌活性提高58.49%.本研究通过紫外诱变选育方法也成功筛选出3株拮抗活性明显提高的菌株，其活性与诱变前相比分别提高了50%，55%和50%，并且该3株细菌遗传性状稳定.但研究中未能对突变株的生防效果进行跟踪实验，也未能明确突变株产生的拮抗物质和抗菌谱是否发生了改变，上述问题还需要进一步深入研究.

综上所述，本研究通过紫外诱变技术选育出3株具有更高拮抗能力的菌株YB-1，YB-2和YB-3，其拮抗活性分别提高50%，55%和50%，且3株细菌的遗传稳定性良好.

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(责任编辑：赵藏赏)

Ultraviolet mutation of antagonistic strainBacillussubtilis8-32

GAO Tongguo, JIA Tianyao, GUO Xiaojun, ZHANG Dongdong, ZHU Baocheng

(College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

Abstract:In order to obtain higher antagonistic activity producing strains, Bacillus subtilis 8-32 which had significant antagonistic against to soybean root rot was used to get more effective strains through ultraviolet mutagenesis method. Conditions for mutagenesis were 30 W UV lamp, 15 cm irradiation distance and irradiation dose of 4 min. Results showed that 100 different morphology colonies of bacteria were picked according to first and second screening, and three strains (YB-1, YB-2, YB-3) which had higher antagonist activities were screened from 100 mutation colonies, their activities were increased by 50%, 55% and 50%, respectively, and the activities were unchanged after 10 generations.

Key words:soybean root rot; Bacillus subtilis; Fusarium oxysporum; UV mutagenesis

基金项目：河北省自然科学基金资助项目(C2015204031);保定市科学技术研究与发展计划项目(13ZN023)

收稿日期：2015-05-20

中图分类号：Q933

文献标志码:A

文章编号：1000-1565(2015)06-0610-06

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.06.010