2015年国内外蜂产品质量安全研究进展（续）

张文文　周金慧　金　玥　张金振　赵文　王琳　李熠　赵静

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

2015年国内外蜂产品质量安全研究进展（续）

张文文周金慧金玥张金振赵文王琳李熠赵静

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

（续《中国蜂业》2016年第3期）

Du等［10］的研究中，建立起含有糖浆标志物的特定色谱和质谱的信息的小规模的数据库，并确定飞行时间的一种简单，快速，有效的超高效液相色谱/四极质谱仪（UHPLC/Q-TOF-MS）方法对掺假蜂蜜进行检测。在玉米糖浆、高果玉米糖浆、转化糖浆和大米糖浆的掺假蜂蜜中；多糖、双果糖酐和2-乙酰基呋喃-3-吡喃葡糖苷用作检测标记。用所建立的方法，可在30 min内快速、便捷地检测出掺假糖浆含量大于10%的蜂蜜。

Wang等［11］根据淀粉糖浆和纯蜂蜜高效液相色谱图中糖类物质出峰时间的不同鉴别糖浆掺假。在糖浆HPLC色谱中，保留时间为15.25 min时出现一个特征峰，但是在纯蜂蜜样品中，相同的保留时间上并没有峰出现。基于单糖、二糖和寡聚糖在色谱图中聚合度为3～7的色谱峰的原则，淀粉糖浆中的此特征峰被鉴定为低聚糖的聚合度大于5的重叠峰。因此，保留时间为15.25 min的特征峰可以作为一个糖浆掺假蜂蜜的HPLC分析标记物。开发的高效液相色谱法应用于100多个商业蜂蜜的掺假检测检查，该方法的检测精度更高，简便，成本低，便于应用于实践中，相关检测机构可以普及HPLC设备和技术到蜂蜜产品的质量控制。

Marc Spiteri等［12］使用核磁共振谱（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）耦合合适的定量方法和统计模型，同时检查单花蜜和杂花蜜的真实性。研究使用一个涵盖大部分经济作物和地理起源的800种蜂蜜基准数据集，其中典型的植物花蜜标记可以用于检查单花花蜜；通过光谱图变化建立起杂花蜜标签；通过200种商品蜜的数据统计比较，确定了糖浆标记信号。虽然该方法只是定性方法，但是相关实验已经证实，当糖浆水平在10%以上时，该方法稳定可靠。采用相同的NMR方法，优化相关参数后进行了葡萄糖、果糖、蔗糖和5-羟甲基糠醛定量。

2.5活性成分分析

蜂产品中主要含有蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、有机酸、色素、芳香物质的高级醇、胶质物、蜂花粉、激素等。此外，蜂蜜是一种糖类的饱和溶液，其中糖类约占3/4；蜂王浆中蛋白质约占干物质的50%，10-羟基-癸烯酸（10-HDA）是蜂王浆中所特有的活性物质；蜂胶中含有大量的酚酸和黄酮类物质等。多年来，使用不同的仪器方法分离检测、鉴定分析蜂产品中已知或未知功能的活性成分，确定其在蜂产品中的含量分布，一直是蜂产品活性成分分析研究领域的热点。

Li等［13］开发NBD-F柱前衍生，高效液相色谱配合荧光检测的方法分析蜂蜜中的脯氨酸。为了确定不同蜂蜜样品中的游离脯氨酸，蜂蜜样品首先用0.1mM硼酸盐缓冲溶液作为萃取溶剂进行超声萃取，经XDB C18柱（150×4.6 mm内径）分离，水相为甲醇：0.1mM乙酸钠缓冲液（pH 7.2）：四氢呋喃（900∶95∶5，分别，v/ v/v），有机相为甲醇，流速1.0 ml/min，运行时间为10 min。该方法的线性范围为0.15～100.00 μg/ml，检出限为3.00 mg/kg，回收率大于90%，日内和日间相对标准偏差均小于4%。该方法成功运用于实际样品中，检出游离脯氨酸含量为80.5～426.4 mg/kg。

H Kaygusuz等［13］通过蜂蜜中矿物质和维生素B2、总酚含量和抗氧化活性表征安纳托利亚石楠花蜂蜜。采用电感耦合等离子体-发射光谱法（ICP-OES）对20个蜂蜜样品中的五种矿物质——钙，钾，铁，铜和锰进行测定；采用毛细管电泳色谱配合荧光检测器测定维生素B2；采用福林-乔卡梯奥法对总酚含量进行测定；通过铜降低抗氧化能力试验（CUPRAC）和总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS）检测蜂蜜的抗氧化能力。石楠花蜂蜜具有较高含量的维生素B2和矿物质元素，同时与橡树花蜜和板栗花蜜相比，石楠花蜜具有更高的抗氧化能力和锰含量，同时，采用主成分分析将石楠花蜂蜜与其他蜜源蜂蜜进行了区分。

新西兰的麦卢卡蜂蜜以其优异的抗菌活性而著称，这主要归功于其活性成分甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）。MGO是在麦卢卡蜂蜜成熟过程中由二羟基丙酮（Dihydroxyacetone，DHA）通过非酶脱水形成。MGO和DHA化学稳定性不高，易发生各种独特的化学反应，如通过Strecker反应生成一个重要的芳香化合物——2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）。J Ru ckriemen等［15］首次使用液液萃取和气相色谱-质谱分析麦卢卡蜂蜜中的2-AP，使用标准品和人造蜂蜜外标法定量。在11个麦卢卡蜂蜜商业样品中，2-AP浓度范围为0.08～0.45 mg/kg。与非麦卢卡蜂蜜相比，含有MGO浓度大于250 mg/kg的麦卢卡蜂蜜中，2-AP含量也显著较高。当高含量MGO被人工添加到杂花蜂蜜中，37℃温度下储存12周后，2-AP浓度增加0.07～0.40 mg/kg，同时，5-羟甲基糠醛（HMF）浓度相应增大。当储存温度变化时，2-AP浓度并没有显著变化。最终结果表明，2-AP与MGO的总含量是麦卢卡蜂蜜质量控制的一个重要参数。

核苷、核苷酸和核酸碱基是存在于蜂王浆（royal jelly，RJ）中的发挥生理活性和生物活性的三种主要物质。Wu等［16］开发一种HPLC法用于同时确定在蜂王浆中的核苷酸、核苷和核碱基，并且调查三种物质在新鲜蜂王浆和商品蜂王浆样品中的含量和分布差别。方法的检出限和定量限分别为12.2～99.6 ng/L和40.8～289.4ng/L，回收率均近100.9%。除尿酸外，其他化合物均在蜂王浆中被检测到。核苷酸、核苷和核碱基的平均含量在新鲜蜂王浆（2682.93 ng/kg）和商品蜂王浆（3152.78 ng/kg）中存在显著差异，新鲜蜂王浆和商品蜂王浆中普遍存在AMP，腺苷和腺嘌呤，其中新鲜王浆中含量水平较高的是ATP，ADP和AMP，而商品蜂王浆样品中IMP，尿苷，鸟苷，胸苷的含量相对较高。所研究的化合物可被用作评估蜂王浆新鲜度和质量的指标。

2.6环境激素

环境激素主要通过污染食品、饮用水及空气来威胁人类健康。该类物质在环境中难以分解，易在生物体内蓄积，极易通过食物链在生态系统内进行生物富集，环境中不易检测的微量或衡量环境激素经过3～4个营养级的富集即可达到惊人的浓度。截至目前，已经列入环境激素的化学物质有70余种，其中对食品和农产品污染最为严重、世界各国最为关注的主要有：制造碳酸醋树脂的双酚A（Bisphenol A，BPA）、用于电器产品的多氯联苯（Polychorinated biphenyls，PCBs）、农药滴滴涕（Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）、塑料增塑剂中的邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）、锌、铅、汞等。蜂产品在生产、储存、运输和销售各个环节都有可能受到环境激素的污染，虽然环境污染的不断加重，蜂产品中环境激素类污染物的分离检测成为近两年来蜂产品质量安全分析领域的热点。

氯酚类物质（chlorophenols，CPs）是广泛存在于水环境中的污染物质，其主要来源为工业排放的废水和废弃物的浸出液、农药、消毒剂和防腐剂等。氯酚是多种含氯酸和有机磷农药的降解产物。2，4-二氯酚，2，4，6-三氯酚和五氯酚等氯酚类化合物毒性高，污染面广，难以降解，因此被美国环保局（U.S.Environmental Protection Agency，EPA）和我国国家环保总局列入优先控制污染物的黑名单。Fan等［17］开发原位生成离子液体-分散液液微萃取（in-situ ionic liquid-dispersive liquid╞liquid microextraction，IL-DLLME）作为预处理方法，高效液相色谱法测定蜂蜜中氯酚。由亲水性离子液体1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸盐（［C4mim］BF4）和离子交换试剂双（三氟甲基磺酰）亚胺金属盐LiNTf2制得疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酰胺酸盐（［C4MIM］NTf2）作为从蜂蜜中提取CPs的萃取剂。然后将分析物富集反萃取到40 μl的0.14MmolNaOH溶液中，最后用高效液相色谱法进行分析。该方法的富集系数高，检测限为0.8～3.2μg/L，回收率为91.60～114.33%，同时简便、快速、环保，并且具有较高的提取效率。

BPA在食品包装领域的用途主要有两个方面：（1）制备添加BPA的塑料包装和容器，使得它们具有耐高温、抗辐射、防冲击性等优点；（2）添加BPA在金属容器内壁化学涂层中，防止因内容物的接触而引起的金属容器腐蚀。因此，BPA被广泛用于食品级包装材料中，并一直广受人们的青睐。Mir Ali Farajzadeh等［18］开发一种分散液液微萃取和气相色谱耦合火焰电离方法检测蜂蜜中的酚醛类抗氧化剂和BPA。研究中对影响萃取效率的主要因素，包括萃取溶剂的类型和量，以及分散溶剂的体积，盐和pH等主要因素进行了优化和验证。最佳提取条件下，检测限和定量限分别为0.4～4.7 ng/g 和1.3～14ng/g。富集系数和提取回收率分别在144～186 和72～93%的范围内。方法精密度在添加浓度100 ng/g水平下的进行评价，相对标准偏差为日内7.6%（n= 6），日间8.3%（n=4）。所提出的方法已被成功地应用到不同的蜂蜜样品和丁基化羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚等酚醛抗氧化剂和BPA的测定。

全氟辛烷基磺酸（perfluooroctanesulfonate，PFOS）和全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）是在环境和食物链中发现的最显著的全氟化合物（全氟化碳），它们被归类为持久性和生物蓄积性的物质。因为这两种物质在复杂的食品基质中含量非常低，所以他们的分析检测非常困难。Magdalena Surma等［19］开发基于分散固相萃取结合UHPLC-MS/MS方法检测蜂蜜样品中的PFOA和PFOS。研究中比较了不同类型的吸附剂：基于聚合物聚苯乙烯-二乙烯苯（ENV）的二氧化硅基（PSA，SAX，NH2，FL和C18）和乙腈作为提取溶剂。对于所有吸附剂，PFOA的回收率为40～84%，PFOS回收率为47～87%。结果表明，以聚合物ENV作为吸附剂时PFOA和PFOS获得最佳回收率84%和87%。结果表明，固相萃取ENV吸附剂可以成功地应用于蜂蜜中PFOA和PFOS的测定。开发方法应用到从欧洲各个国家采集的蜂蜜样品中，检测到PFOA的含量范围为0.103～0.223 ng/g，而PFOS含量低于定量限，并没有被检测到。

MM Gómez-Ramos等［20］使用飞行时间气相色谱串联高分辨率质谱对蜂蜡中的环境污染物进行筛选，用于非靶向环境污染物的调查以及表征蜂蜡样品的有机污染图案。该方法首先对目标物进行简单提取，随后用耦合飞行时间气相色谱的高分辨率质谱（GC-TOFMS）在电子轰击电离（EI）模式下进行分离检测。进行非靶向污染物调查的筛选方法包括通过反卷积方法对初始峰值检测和匹配具有标准物质的第一级质谱EI-MS质谱库。为了获得进一步的确定污染物的结构表征，除了代表离子的分子式，还需要至少另外两个具有精确质量得分的碎片离子（质量误差＜5ppm）。方法已经初步用于鉴定蜂蜡中环境污染物的化学基团，如邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）和多环芳香烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等一些常用于GC分析的污染物。

3总结

2015年已经正式发表的有关于蜂产品质量安全的文献主要关注点仍然在于农兽药残和重金属残留分析，其主要趋势是开发更简单、快速、环保的前处理方法，配合高分辨检测器实现多种目标化合物的高通量分析，更高的灵敏度和分辨率仍然是科研工作者的不断追求。另外，环境激素类物质是研究蜂产品质量安全领域新的着眼点，已有关于邻苯二甲酸酯、双酚A、多环芳烃等环境污染物的相关文献发表。蜂产品中尚不能明确结构或不能准确定量的具有生物活性的物质的分离鉴定也是科研工作者不断探索的领域。

本文仅列举了部分具有代表性的相关文献，希望对今后蜂产品质量安全研究内容范围和深度有帮助。

［1］R Galarini，G Saluti，D Giusepponi，et al.Multiclass determination of 27 antibiotics in honey.Food Control，2015，48：12-24.

［2］祝子铜，雷美康，彭芳，等.快速溶剂萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂花粉中氯霉素［J］.食品工业科技.2015，30：68-71.

［3］Y Wang，S Ji，F Zhang，et al.A polyvinyl alcohol-functionalized sorbent for extraction and determination of aminoglycoside antibiotics in honey.Journal of Chromatography A，2015，17：32-36.

［4］粟有志，李芳，齐鑫，等.QuEChERS-高效液相色谱/串联质谱法同时测定蜂蜜中9种新烟碱类杀虫剂残留［J］.分析科学学报，2015，31：203-207.

［5］Y Li，RA Kelley，TD Anderson，et al.Development and comparison of two multi-residue methods for the analysis of select pesticides in honey bees，pollen，and wax by gas chromatography╞quadrupole mass spectrometry.Talanta，2015，140：81-87.

［6］Y Zhang，D Chen，Y Zhao.Determination of triazine pesticides in honey by ultra high performance liquid chromatography-high resolution isotope dilution mass spectrometry combined with dispersive micro-solid phase extraction.Analytical Methods，2015，7：9867-9874.

［7］FC Rosa，FA Duarte，JN Paniz，et al.Dispersive liquid╞liquid microextraction：An efficient approach for the extraction of Cd and Pb from honey and determination by flame atomic absorption spectrometry.Microchemical Journal，2015，123：211-217.

［8］AS do Nascimento，LC Marchini，CAL de Carvalho，et al.Determining the Levels of Trace Elements Cd，Cu，Pb and Zn in Honey of Stingless Bee（Hymenoptera：Apidae）Using Voltammetry.Food and Nutrition Sciences，2015，6：591-596.

［9］HM Aghamirlou，M Khadem，A Rahmani，et al.Heavy metals determination in honey samples using inductively coupled plasmaoptical emission spectrometr.Journal of Environmental Health Science and Engineering，2015，13：39-47.

［10］B Du，L Wu，X Xue，et al.Rapid Screening of Multiclass Syrup Adulterants in Honey by Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography/Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of agricultural and food chemistry，2015，63：6614-6623.

［11］S Wang，Q Guo，L Wang，et al.Detection of honey adulteration with starch syrup by high performance liquid chromatography.Food chemistry，2015，172：669-674.

［12］M Spiteri，E Jamin，F Thomas，et al.Fast and global authenticity screening of honey using 1 H-NMR profiling.Food Chemistry，2015，189：60-66.

［13］Y Li，J Zhou，X Xue，et al.Fluorometric determination of proline in honey by high-performance liquid chromatography after pre-column derivatization with 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole（NBD-F）.Analytical Methods，2015，7：7625-7630.

［14］H Kaygusuz，F Tezcan，FB Erim，et al.Characterization of Anatolian honeys based on minerals，bioactive components and principal component analysis.LWT-Food Science and Technology，2016，68：273-279.

［15］J Ru ckriemen，U Schwarzenbolz，S Adam，et al.Identification and Quantitation of 2-Acetyl-1-pyrroline in Manuka Honey（Leptospermum scoparium）.Journal of agricultural and food chemistry，2015，63：8488-8492.

［16］L Wu，L Chen，JN Selvaraj，et al.Identification of the distribution of adenosine phosphates，nucleosides and nucleobases in royal jelly.Food chemistry，2015，173：1111-1118.

［17］C Fan，N Li，X Cao.Determination of chlorophenols in honey samples using in-situ ionic liquid-dispersive liquid╞liquid microextraction as a pretreatment method followed by high-performance liquid chromatography.Food chemistry，2015，174：446-451.

［18］MA Farajzadeh，M Abbaspour，MRA Mogaddam，et al.Determination of Some Synthetic Phenolic Antioxidants and Bisphenol A in Honey Using Dispersive Liquid╞Liquid Microextraction Followed by Gas Chromatography-Flame Ionization Detection.Food Analytical Methods，2015，8：2035-2043.

［19］M Surma，W Wiczkowski，E Cie lik，et al.Method development for the determination of PFOA and PFOS in honey based on the dispersive Solid Phase Extraction（d-SPE）with micro-UHPLC╞MS/MS system.Microchemical Journal，2015，121：150-156.

［20］M Gómez-Ramos，A García-Valcárcel，J Tadeo，et al.Screening of environmental contaminants in honey bee wax comb using gas chromatography╞high-resolution time-of-flight mass spectrometry.Environmental Science and Pollution Research.2016，23：4609-4620.（NBD-F），Analytical Methods，7（2015）7625-7630.

［14］H.Kaygusuz，F.Tezcan，F.B.Erim，et al.Characterization of Anatolian honeys based on minerals，bioactive components and principal component analysis，LWT-Food Science and Technology，（2015）.

［15］J.Ru ckriemen，U.Schwarzenbolz，S.Adam，T.Henle.Identification and Quantitation of 2-Acetyl-1-pyrroline in Manuka Honey （Leptospermumscoparium），Journal ofagricultural and food chemistry，63（2015）8488-8492.

［16］L.Wu，L.Chen，J.N.Selvaraj，et al.Identification ofthe distribution of adenosine phosphates，nucleosides and nucleobases in royal jelly，Food chemistry，173（2015）1111-1118.

［17］C.Fan，N.Li，X.Cao.Determination of chlorophenols in honey samples using in-situ ionic liquid-dispersive liquid╞liquid microextraction as a pretreatment method followed byhigh-performance liquid chromatography，Food chemistry，174（2015）446-451.

［18］M.A.Farajzadeh，M.Abbaspour，M.R.A.Mogaddam.H.Ghorbanpour，Determination of Some Synthetic Phenolic Antioxidants and Bisphenol A in Honey Using Dispersive Liquid╞Liquid Microextraction Followed by Gas Chromatography-Flame Ionization Detection，Food Analytical Methods，（2015）1-9.

［19］M.Surma，W.Wiczkowski，E.Cie lik，et al.Method development for the determination of PFOA and PFOS in honey based on the dispersive Solid Phase Extraction（d-SPE）with micro-UHPLC MS/MS system，Microchemical Journal，121（2015）150-156.

［20］M.Gómez-Ramos，A.García-Valcárcel，J.Tadeo，et al. Screening of environmental contaminants in honey bee wax comb using gas chromatography╞high-resolution time-of-flight mass spectrometry，EnvironmentalScienceandPollutionResearch，（2015）1-12.