动物RNA病毒反向遗传学操作技术及应用进展

孙玉章，倪雪霞，李金明，吴发兴，王永玲（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）



动物RNA病毒反向遗传学操作技术及应用进展

孙玉章，倪雪霞，李金明，吴发兴，王永玲
（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

摘 要：本文简述了反向遗传操作技术的基本原理以及近年来动物RNA病毒基因复制与表达调控机理、病毒与宿主间的相互作用，以及构建新型病毒载体和研发新型疫苗等方面的研究进展。

关键词：动物RNA病毒；反向遗传学；病毒拯救；新型疫苗；应用进展

多数动物RNA病毒引起难以控制、危害严重的疫病，是病毒学领域重要的研究对象之一。但RNA病毒（除逆转录RNA病毒外）的复制周期并不经历DNA中间阶段，重组DNA技术不能直接运用于动物RNA病毒基因组的修饰与分析，而且RNA分子在体外较DNA分子更难以操作。近几十年发展起来的反向遗传学技术使这一问题得到了近乎完美地解决，极大地促进了对动物RNA病毒分子生物学的研究，并衍生出了“反向疫苗学”等新兴学科。

反向遗传学技术是以生物基因为主要研究对象，基于对基因核苷酸序列的人为操作，探索基因调控的分子机制以及生命发生发展的本质现象和规律等。广义的反向遗传学技术是指与反向遗传学操作相关的各种技术的统称，包括定点突变、RNA干扰、基因沉默和基因体外转录等，是重组DNA技术应用范围的扩展与延伸。狭义的反向遗传学技术仅指基因体外转录技术中的感染性cDNA克隆技术，即早期文献中通称的“病毒拯救”技术。本文仅对这一技术在动物RNA病毒中的原理及应用进展进行简述。

1　正链RNA病毒的反向遗传操作技术

根据病毒的转录复制方式，正链RNA病毒可以分为两类：第一类包括小RNA病毒科、黄病毒科等，病毒基因组仅转录产生一种mRNA，然后翻译为一个多聚体蛋白，由病毒本身或宿主细胞内的酶切割为多个功能性蛋白；第二类包括披膜病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科和动脉炎病毒科等，其共有特征是通过转录为多个亚基因组RNAs来进行基因表达。

正链RNA病毒基因组本身可以作为mRNA来利用宿主细胞的翻译系统表达病毒蛋白，所以只要将其基因组RNA或其类似物导入合适的细胞系即可组装出具有感染性的子代正链RNA病毒。因此正链RNA病毒的反向遗传学操作相对容易获得成功，其关键环节就是感染性分子克隆的精确构建。感染性分子克隆包括感染性cDNA克隆和感染性体外转录本。

构建感染性cDNA克隆是通过反转录—聚合酶链反应扩增RNA病毒基因组的全长或分段的cDNA片段，然后利用特定的限制性酶切位点将其克隆入合适的载体，使之受控于强的转录启动子并转染适当细胞系，病毒的全长cDNA克隆转录为mRNA并启动感染循环，最终获得有感染性的子代病毒颗粒。1981年，Racaniello等通过这种方法最先得到了具有感染性的脊髓灰质炎病毒（PV）。感染性体外转录也是先通过RT-PCR获得病毒基因组全长cDNA克隆，在体外进行转录获得具有感染性的基因组RNA之后，用此RNA转染适当细胞系以获得感染性的病毒颗粒。2003年，Baranowski等用这种方法得到了有侵染性的口蹄疫病毒（FMDV）。

在构建RNA病毒的感染性分子克隆时，成功与否的另一个关键因素是病毒基因组的大小。一般而言，病毒基因组在15 kb以内的比较容易拯救成功。但长达28.5 kb的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）已经可以被成功克隆，这一技术的突破预示着所有RNA病毒理论上都能够进行反向遗传操作。

2　负链RNA病毒的反向遗传操作技术

负链RNA病毒根据其基因组结构可分为两大类：不分节段的博尔纳病毒科、弹状病毒科、副黏病毒科和丝状病毒科；分节段的正黏病毒科、布尼亚病毒科和砂粒病毒科等。负链RNA病毒和正链RNA病毒最重要的区别就是其基因组RNA在宿主细胞体内不能启动感染循环，即使其完全互补的正链基因组RNA（cRNA）也不能作为mRNA依赖宿主细胞的翻译系统进行表达，因此也没有感染性。只有病毒的基因组RNA与核衣壳蛋白、磷酸化蛋白以及依赖RNA的RNA聚合酶蛋白共同形成功能性的核糖核蛋白复合体（ribonucleoprotein complex， RNP）之后才具有感染性，即RNP的形成对负链RNA病毒的转录和复制是绝对必要的。负链RNA病毒的RNA聚合酶具有复制酶和转录酶的双重功能，能够识别其基因组内部的转录终止信号和重启信号。

负链RNA病毒反向遗传操作体系主要包括基因组全长感染性cDNA克隆的构建及改造、辅助质粒的构建及功能性检定、共转染拯救病毒和新生子代病毒有关特性的鉴定与应用等内容。由于除了需要构建精确的全长cDNA克隆外，还必须使之在细胞内转录为基因组RNA时与核衣壳蛋白、磷酸化蛋白和RNA聚合酶蛋白共同结合形成RNP，只有这样才有可能获得具有感染性的子代病毒颗粒，因此负链RNA病毒反向遗传操作体系的建立与正链RNA病毒相比更为复杂困难，负链RNA病毒拯救成功的实例也较正链RNA病毒少的多。负链RNA病毒反向遗传操作体系的建立首先应该归功于Conzelmann团队于1994年建立的完全依赖质粒转染系统的狂犬病病毒RABV拯救体系，从此打开了负链RNA病毒拯救的大门。2000年流感病毒IV的8质粒转染系统的建立标志着以病毒拯救技术为代表的反向遗传学操作技术进入了一个高峰期。

3　双链RNA病毒的反向遗传操作技术

双链RNA病毒包含一些对人或动物造成重大危害的病毒，如双RNA病毒科的传染性法氏囊病病毒（IBDV）和呼肠孤病毒科中的蓝舌病毒（BTV）、轮状病毒（RV）、非洲马瘟病毒（AHSV）等。其病毒基因组结构为互补双链RNA，在宿主细胞质中以非对称全保留的方式转录并复制产生子代病毒双链RNA，最终与病毒蛋白组装并出膜，完成一个完整的生命周期。

由于双链RNA病毒结构上的特殊性，其反向遗传学操作具有相当的难度，其中呼肠孤病毒更是公认的最难建立反向遗传学操作体系的RNA病毒之一。借助于辅助病毒感染，Roner等于1990年最早建立了正呼肠孤病毒的反向遗传操作体系；但是直到2004年，通过这一体系的不断完善并应用于对基因组包装信号区域的初步定位，才标志着呼肠孤病毒反向遗传操作体系的正式成熟。尽管如此，目前双链RNA病毒的反向遗传操作体系的建立策略并不统一：IBDV的拯救基本上是采用感染性cDNA克隆体内转染的方法，而BTV和AHSV则主要是采用构建感染性体外转录本的方法。

无论是采取感染性cDNA克隆体内转染的方法还是构建感染性体外转录本，动物RNA病毒反向遗传操作技术的核心都是在合适的宿主细胞内形成病毒基因组转录本RNA。早期病毒拯救体系的低效很大程度上是由于无法获得具有精确末端的病毒基因组转录本RNA。现在的通行策略是在病毒基因组感染性cDNA分子克隆的两端分别引入具备自剪切功能的核酶序列，一般是在病毒感染性cDNA分子克隆的5’末端引入具有3’末端剪切功能的锤头状核酶，在感染性cDNA分子克隆的3’末端引入具有5’末端剪切功能的丁肝核酶。另外通过密码子优化和调控序列的优化都能在一定程度上提高病毒拯救的效率。病毒拯救体系的效率与转染质粒浓度和细胞密度均有一定关系，合适的质粒浓度比和细胞密度都需要经过大量的重复实验确定最优比。同时辅助转染表达病毒其他蛋白的质粒或者构建稳定表达辅助蛋白的细胞系都能够在一定程度上提高拯救病毒的效率。

4　动物RNA病毒反向遗传操作技术的应用进展

4.1研究病毒基因组复制与表达调控机理

1989年，Egelman等首先在对仙台病毒（SeV）的研究中发现其病毒基因组核苷酸总数为6的倍数，随后其他研究者在麻疹病毒（MV）及新城疫病毒（NDV）中也发现了这一规律，称为“6碱基原则”。2000年，Peeters等[1]通过构建NDV的微型基因组完美的证明了只有遵循“6碱基原则”的病毒基因组才能够有效地转录、复制和包装。

1999年，Peeters等[2]将NDV F基因的112位、115位和117位3个位点的非碱性氨基酸全部突变为碱性氨基酸，得到了一株具有明显强毒株特征的NDV毒株，证明了F基因裂解位点区的氨基酸序列是决定毒力的关键因素。而后Huang等[3]将NDV强毒株和弱毒珠的HN基因互换，获救毒株的毒力均发生了变化，印证了F基因的裂解位点不是决定NDV毒力的唯一因素的假说。2006年，Takayama-Ito等[4]将高度致弱的RABV毒株G蛋白的第333位替换为精氨酸后毒性复强。2011年，Rieder等[5]发现RABV的P蛋白基因中链区176～181位氨基酸序列的缺失导致病毒丧失了拮抗干扰素的能力。Hoffmann等通过构建微型基因组证实，同源或异源病毒的顺式作用序列对于病毒颗粒的壳体化和转录具有同样的作用，但病毒颗粒的包装出膜则严格依赖于同源病毒的顺式作用序列。动物RNA病毒基因组的末端序列富含转录调控信号，对于维持动物RNA病毒的结构和功能的完整性非常重要，因此无论正链还是负链RNA病毒基因组的复制和包装，都必须具有精确的末端。Brown等[6]证实精确的3’端非编码区对于拯救PV非常必要，非病毒末端的RNA转染常导致产生缺失性突变体表型。国内学者曾将以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美株为骨架构建的全长cDNA克隆5’端非编码区序列替换为PRRSV欧洲株的相应序列，嵌合病毒失去了感染性。尽管目前著述众多，然而末端调控序列对病毒拯救的确切影响尚无定论。

4.2构建重组病毒载体和新型疫苗的研制

1996年，Bukreyev等用呼吸道合胞体病毒（RSV）表达了外源报告基因，对用获救病毒做载体进行了初步探索。Nakaya等[7]在NDV P和M基因之间插入了流感病毒的血凝素基因，构建的重组病毒经过小鼠体内实验证明，其能够抵抗致死剂量流感病毒的攻击。Huang等[8]用重组NDV表达IBDV的VP2蛋白对NDV强毒株和IBDV强毒株的攻击均能起到相当良好的保护率。

基于对病毒基因组感染性cDNA克隆的改造，获救病毒作为载体表达外源基因技术可以应用于研制分子标记疫苗和嵌合体疫苗。2001年，Peeters等[9]将NDV HN基因用含禽副黏病毒4型HN基因的嵌合体基因取代，救获的嵌合体病毒不仅可以刺激机体产生对NDV强毒株的免疫保护，而且根据其对HN所产生的抗体及血清学分析即可区别疫苗免疫与野生毒感染。

对于没有自然弱毒株的病毒，反向遗传学操作技术在研究新型疫苗方面展现出巨大的优势。1997年前后，鹅源新城疫的暴发流行给我国的家禽养殖业造成了巨大的经济损失，其病原即为基因VII型NDV。胡顺林[10]、孙玉章[11]等先后构建了鹅源NDV野毒株的全长cDNA感染性克隆，在利用反向遗传学操作技术获得用于水禽新城疫防制的人工疫苗候选毒株方面进行了有益地尝试。作为一种高效的疫苗技术储备，目前国内已经对多种动物流感病毒和部分外来动物疫病病原建立了反向遗传操作技术平台。

4.3研究病毒与宿主间的相互作用关系

应用反向遗传学技术研究病毒的受体具有很大的理论和技术优势，其中FMDV和RABV的研究已经建立了相对成熟的研究模型，期包含两种基本模式：一是通过反向遗传学技术对病毒基因组的受体结合位点进行人为突变，从而研究病毒与宿主受体间的相互作用；二是通过构建表达宿主细胞受体的重组病毒，用于研究宿主细胞与病毒蛋白的相互作用。

Conzelamnn团队[12-15]应用反向遗传技术对RABV进行基因重组和遗传修饰，从而阐明了RABV在宿主神经元内的增殖和跨突触传播机理。有学者曾提出通过反向遗传技术构建禽-猪-人源戊肝病毒嵌合体来研究戊肝病毒的蛋白功能、组织嗜性以及跨种传播机制等非常有意义。

通过对所构建的病毒全长cDNA感染性克隆进行相应功能基因的突变、缺失、插入和颠换等操作，然后利用救获的子代病毒感染宿主细胞并检测胞内外免疫信号通路的变化，可以精确定位并探索病毒基因组及蛋白功能，从而可以更深入地研究病毒与宿主之间的相互修饰、相互影响的分子机制。

5　结语

作为目前国内外众多分子生物学实验室必备的基础技术平台之一，反向遗传学操作技术已经被广泛应用于生命科学研究的各个领域，其应用范围不仅包括研究动物病毒的基因复制与表达调控机理、病毒与宿主间的相互作用，还包括抗病毒策略与基因治疗研究、构建新型靶向病毒载体和进行新型基因工程疫苗的研发，以及作为小反刍兽疫、施马伦贝格病和非洲猪瘟等重大外来动物疫病的基础性防控技术储备等。

近十几年来，越来越多的国内外实验室先后建立了多种动物RNA病毒的反向遗传操作体系，技术层面更加趋于简便高效。总体上来看，国内的研究多集中于新型病毒载体或基因工程疫苗研究，与国外研究者更多集中于免疫信号通路等致病机理的研究热点相比还有相当差距。随着分子生物学日新月异的发展，相信以后还会不断有新发现或新改造的生物酶类或生物载体等作为强有力的分子工具，应用到反向遗传操作技术中来，从而不断扩大反向遗传操作技术的应用广度和深度。

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（责任编辑：朱迪国）

Development and Application of the Reverse Genetics Technology for Animal RNA Viruses

Sun Yuzhang，Ni Xuexia，Li Jinming，Wu Faxing，Wang Yongling
（China Animal Health & Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：In this review，the principle of reverse genetics technology was briefl y described for animal RNA viruses. Further，the development and the recent advances of this technology were introduced in viral gene replication and regulation mechanism，viral pathogenesis mechanism，virus-hostcell interactions and novel vaccine vectors over the past decades.

Key words：animal RNA viruses；reverse genetics technology；virus rescue；novel vaccines；development and application

中图分类号：S851.3

文献标识码：A

文章编号：1005-944X（2016）05-0068-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.05.022