不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病大鼠周围神经功能及多元醇代谢通络的影响

贲　莹　张凤华　张　冬　方　倩　杜澍金

(河北医科大学中西医结合学院，河北　石家庄　050091)



不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病大鼠周围神经功能及多元醇代谢通络的影响

贲莹张凤华张冬方倩杜澍金

(河北医科大学中西医结合学院，河北石家庄050091)

摘要〔〕目的探讨不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠周围神经功能及多元醇代谢通路的影响。方法采用链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射诱导建立 SD 大鼠DPN模型，并随机分为模型组、黄芪60 g组、黄芪120 g组和甲钴胺组，每组10只。黄芪60 g组和黄芪120 g组分别用含对应量黄芪的补阳还五汤浓煎剂灌胃，甲钴胺组用175 μg·kg-1·d-1甲钴胺灌胃。另设正常组10只。给药12 w后，检测空腹血糖(FBG)、坐骨神经传导速度，醛糖还原酶(AR)和Na+-K+-ATP酶活性及山梨醇、肌醇、果糖等多元醇含量。结果与模型组比较，黄芪120 g组和甲钴胺组MCV明显提高(P<0.05)；黄芪60 g组、黄芪120 g组和甲钴胺组SCV、肌醇含量显著提高(P<0.05)，其中黄芪120 g组增高更明显(P<0.01)；AR活性、果糖含量明显下降(P<0.05)，黄芪120 g组降低更显著(P<0.01)。黄芪120 g组山梨醇含量较模型组显著下降(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶活性显著升高(P<0.05)。黄芪120 g组山梨醇及果糖含量较黄芪60 g组下降(P<0.05)。结论补阳还五汤能有效抑制 DPN 大鼠的多元醇代谢通路，发挥其神经保护作用，以120 g黄芪剂量补阳还五汤的抗氧化作用为佳。

关键词〔〕糖尿病周围神经病变；多元醇代谢通路；补阳还五汤；黄芪

第一作者：贲莹(1979-)，女，讲师，硕士，主要从事中西医结合神经病学研究。

糖尿病周围神经病变(DPN)是常见的糖尿病慢性并发症之一，发病率较高，其发病机制尚未完全阐明，但大量研究表明多元醇通路的激活是引发DPN的重要因素之一。中医认为本病主要为络气虚滞，淤血阻络，临床治法上应用补气活血通络的补阳还五汤加减治疗取得了较好的疗效。但对其能否通过抑制多元醇通路代谢而减少周围神经损伤，还缺少客观实验证据。本研究探讨补阳还五汤对DPN大鼠周围神经功能和多元醇代谢通络的影响，并观察不同黄芪剂量补阳还五汤的疗效，以期明确补阳还五汤方发挥治疗作用的途径、效果及方中黄芪的最佳剂量。

1材料与方法

1.1动物试剂与药物雄性SD大鼠50只，体质量180～220 g(2月龄左右)，购自河北医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(冀)2003-1-003。链脲佐菌素(STZ)购于Sigma公司；补阳还五汤原方来源《医林改错》，黄芪120 g，当归6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g，简称黄芪120 g组。另设黄芪60 g，其余药物剂量不变，简称为黄芪60 g组。以上两组药物分别加水浸泡2 h，水煎2次，每次40 min，先后两次药液合并、浓缩，分别制成含生药2.4、1.36 g/ml的药液。甲钴胺(弥可保)，日本卫材株式会社，批号：0006715；Na+，K+-ATP酶活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2仪器One touch Ⅱ型血糖仪(美强生公司)；DANTEC Cantata肌电图诱发电位仪；MPF-4型荧光分光光度计(日本日立公司)；GC6890气相色谱分析仪(美国安捷伦公司)。

1.3方法

1.3.1分组、建立动物模型50只SD大鼠按体重相似随机分为5组，正常组、模型组、黄芪60 g组、黄芪120 g组、甲钴胺组，每组10只。在禁食12 h后模型组、黄芪60 g组、黄芪120 g组、甲钴胺组大鼠给予一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后大鼠禁食8 h测鼠尾静脉血测血糖≥16.7 mmol/L确立为糖尿病大鼠模型，正常组大鼠注射等量的柠檬酸缓冲液。

1.3.2给药给药造模成功立即开始灌胃，黄芪60 g组、黄芪120 g组按10 ml·kg-1·d-1分别用相应黄芪量药液灌胃；甲钴胺组按175 μg·kg-1·d-1甲钴胺灌胃；正常组和模型组给予等体积的蒸馏水。实验期间自由饮食，连续给药12 w。

1.4观察指标

1.4.1坐骨神经传导速度测定给药结束后，水合氯醛麻醉大鼠，用肌电图仪检测大鼠右侧坐骨神经传导速度。第一刺激部位在坐骨窝，第二刺激部位在踝部。均用2个针电极经皮插入，电极间距在2 mm，接地于尾部，保持皮温 30℃。①运动神经性传导速度(MCV)：用方形波(10～20 mA，40 μs脉波宽) 刺激神经，用2个针电极在同侧的足部骨间肌记录复合肌肉动作电位。记录3对不同M波的潜伏期，取平均值，两个刺激部位间的传导时间为近端和远端潜伏期差，用弯角规测量两个刺激部位间的距离。MCV(m/s)=距离/潜伏期差值。②感觉神经传导速度(SCV)：用方形波(10～20 mA，40 μs脉波宽)记录6对在坐骨窝和踝激发的H反射潜伏期，用弯角规测量两个刺激部位间的距离。SCV(m/s)=距离/潜伏期差值。

1.4.2醛糖还原酶(AR)活性测定实验12 w后取大鼠坐骨神经，冷生理盐水冲洗、称重后，加入1.5 ml的冷生理盐水匀浆，离心，所得上清为坐骨神经匀浆液。考马斯亮蓝法测定匀浆液的蛋白含量。参照文献的方法检测坐骨神经 AR 活性〔1〕。

1.4.3多元醇含量的测定取坐骨神经匀浆液0.4 ml，加入10%三氯醋酸0.1 ml，振荡10 s，静置2 min，离心15 min，取上清液0.3 ml，减压蒸干。加盐酸羟胺10 mg，吡啶0.5 ml，90℃加热15 min，不断振荡。取出冷却至室温。加入醋酐0.5 ml，90℃水浴反应20 min，取出，90℃水浴减压浓缩至干。加入0.5 ml氯仿，溶解，采用毛细管柱气相色谱法分离测定样品中山梨醇、肌醇、果糖含量，并折算为匀浆中每1 mg蛋白中所含测定物的量。测定样本中各加入0.25 mg 6，7-二甲氧基香豆素作为内标。色谱条件：毛细管柱：HP-5(0.32 mm×30 m)；载气：氮气；流速：0.5 ml/min；初始温度：160℃；最高温度：320℃；检测器：氢火焰检测器；进样量：0.4 μl。

1.4.4Na+-K+-ATP酶活性测定采用购自南京建成生物工程研究所的Na+-K+-ATP酶活性测定试剂盒，严格依照说明进行操作，测定并计算坐骨神经匀浆液中的Na+-K+-ATP酶活性。

1.5统计学方法采用SPSS11.0软件，行方差分析和SNK法两两比较。

2结果

2.1FBG变化模型组、黄芪120 g组、黄芪60 g组、甲钴胺组FBG显著高于正常组(P<0.05)。黄芪120 g组FBG略低于模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各组坐骨神经传导速度的比较与正常组比较，模型组坐骨神经MCV和SCV明显减慢(P<0.01)；与模型组比较，黄芪120 g组和甲钴胺组MCV明显提高(P<0.05)；黄芪60 g组、黄芪120 g组和甲钴胺组SCV显著提高，其中黄芪120 g组SCV增高更明显(P<0.01)；三药物干预组间比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.3各组坐骨神经AR活性比较模型组比正常组AR活性均明显升高(P<0.01)。与模型组比较，黄芪60 g组、黄芪120 g组及甲钴胺组AR活性降低(P<0.05，P<0.01)，三药物干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4各组坐骨神经多元醇含量比较模型组比正常组山梨醇、果糖含量显著升高，肌醇含量显著下降(P<0.01)；与模型组比较，黄芪120 g组山梨醇含量显著下降(P<0.01)，黄芪60 g组、黄芪120 g组及甲钴胺组肌醇含量升高，果糖含量降低(P<0.05，P<0.01)，黄芪120 g组山梨醇及果糖含量较黄芪60 g组下降(P<0.05)。见表2。

2.5各组坐骨神经Na+-K+-ATP酶活性比较模型组比正常组Na+-K+-ATP酶活性显著降低。黄芪120 g组Na+-K+-ATP酶活性较模型组显著升高(P<0.05)。三药物干预组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别FBG(mmol/L)4w8w12wMCV(m/s)SCV(m/s)正常组4.96±0.631)5.02±0.581)4.87±0.511)45.26±4.351)46.45±7.121)模型组26.54±3.7725.83±4.1426.10±3.8130.17±5.1629.21±9.38黄芪60g组27.21±3.2626.36±3.5225.97±2.7234.82±6.3637.06±6.742)黄芪120g组26.25±3.8925.74±3.1624.16±3.0537.36±6.222)40.17±5.251)甲钴胺组27.12±4.7627.03±3.8526.68±3.7236.30±7.122)38.14±6.862)

与模型组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

组别AR活性(U/mgprot)多元醇含量(μg/mgprot)山梨醇肌醇果糖Na+-K+-ATP酶活性(μmolPi·mg-1·h-1)正常组11.21±3.851)126.59±27.331)24.17±5.681)112.58±24.751)0.79±0.081)模型组17.86±4.54219.43±42.8016.36±3.20197.84±41.110.27±0.21黄芪60g组13.73±4.472)192.25±44.0119.28±4.342)160.73±34.972)0.41±0.27黄芪120g组12.23±4.061)154.56±33.981)3)20.65±3.041)128.36±32.811)3)0.62±0.412)甲钴胺组13.42±3.832)184.35±45.2719.74±3.352)156.75±39.182)0.46±0.38

与模型组比较：1)P<0.01，2)P<0.05；与黄芪60 g组比较：3)P<0.05

3讨论

DPN是糖尿病主要的慢性并发症，其发病机制目前尚未完全明了，一般认为与多元醇通路、己糖胺途径、蛋白激酶C途径的激活和糖基化终产物的形成、微血管病变、氧化应激反应等诸多因素有关〔2，3〕。多元醇通路代谢增强是引发糖尿病周围神经病变的重要因素。AR是此途径中的第一个酶，亦被认为是引发糖尿病周围神经病的关键因素〔4〕。组织中葡萄糖大量增加时，AR被激活，葡萄糖被大量转化为山梨醇，后者还可进一步转化为果糖。山梨醇及果糖等多元醇含量增多导致胞内产生高渗状态；为了维持内环境稳定，其他渗透物将会减少，如肌醇(在信号转导中起重要作用)、牛磺酸(重要的抗氧化剂)等〔5〕。而肌醇的减少又影响蛋白激酶C和钙调节蛋白的活性，导致Na+-K+-ATP酶活性下降，细胞结构和功能的完整性受损，进而引起周围神经髓鞘分离、脱失，轴索变性以及神经传导速度减慢等改变〔6〕。

本实验结果显示，补阳还五汤可使DPN大鼠神经传导速度增高，降低体内AR活性使山梨醇、果糖含量下降，肌醇含量升高，从而增强Na+-K+-ATP酶活性。此结果提示补阳还五汤能有效减低DPN大鼠多元醇通路代谢，发挥其保护作用。

补阳还五汤为清代医家王清任所创，配伍用量特点为君药黄芪剂量是其他活血通络药总和的5倍，《医林改错》中写到 “黄芪用一二两，以后渐加至四两”，重用黄芪旨在令气旺血行而瘀去络通。本结果中黄芪120 g组山梨醇、果糖含量显著低于60 g组，说明随着黄芪剂量的增大，补阳还五汤的神经保护作用愈发显著，临床治疗时推荐按王清任原方120 g黄芪用量使用。

参考文献4

1周云平，张家庆.醛糖还原酶(AR)的荧光光度法测定及其在糖尿病大鼠晶体AR测定中的应用〔J〕.中华内分泌代谢杂志，1989；5(7)：159.

2Yagihashi S，Yamagishi SI，Wada R，etal.Neuropathy in diabetic mice over-expressing human aldose reductase and effects of aldose reductase inhibitor〔J〕.Brain，2001；124：2448-58.

3Hafer-Macko CE，Ivey FM，Gyure KA，etal.Thrombomodulin deficiency in human diabetic nerve microvasculature〔J〕.Diabetes，2002；51(6)：1957-63.

4Gabbay KH.Aldose reductase inhibition in the treatment of diabetic neuropathy：where are we in 2004〔J〕.Curr Diab Rep，2004；4(6)：405-8.

5Vincent AM，Feldman EL. New insights into the mechanisms of diabetic neuropathy〔J〕.Rev Endocr Metab Disord，2004；5(3)：227-36.

6袁耀宗，王兴鹏.胰腺病学新进展与新技术〔M〕.上海：上海科学技术文献出版社，2001：276-7.

〔2014-10-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：河北省教育厅科学技术研究青年基金项目(QN2014019)

中图分类号〔〕R285.5〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7040-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.032