miRNA对垂体瘤细胞株中增生细胞核抗原、垂体瘤转化基因、血管内皮细胞生长因子表达的影响

李　东

(寿光市中医医院神经外科，山东　寿光　262700)



miRNA对垂体瘤细胞株中增生细胞核抗原、垂体瘤转化基因、血管内皮细胞生长因子表达的影响

李东

(寿光市中医医院神经外科，山东寿光262700)

摘要〔〕目的探讨微小RNA(miRNA)对垂体瘤细胞株中增生细胞核抗原(ki-67)、垂体瘤转化基因(PTTG)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达影响。方法将培养好的人垂体瘤细胞放入A、B两培养瓶中培养，其中A培养瓶培养基中加入标记的miRNA基因2 μl，而B培养瓶只是加入等量的培养基，采用RT-PCR及 Western印迹法检测培养24 h后人垂体瘤细胞中ki-67、PTTG、VEGF基因及蛋白表达水平。结果①A培养瓶加标记的miRNA基因后培养24 h，人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF mRNA表达水平明显低于B培养瓶(P<0.05)；②A培养瓶加入miRNA基因后培养24 h，人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF蛋白表达水平明显低于B培养瓶(P<0.05)。结论垂体瘤细胞中ki-67、PTTG、VEGF处于高水平表达，而miRNA能够明显降低ki-67、PTTG、VEGF的表达，抑制细胞的生长，对临床具有指导意义。

关键词〔〕微小RNA；垂体瘤；增生细胞核抗原；垂体瘤转化基因；血管内皮细胞生长因子

第一作者：李东(1979-)，男，主治医师，主要从事神经外科学研究。

垂体腺瘤虽多数为良性肿瘤，但是过度生长的垂体细胞分泌和释放各种分泌素，导致临床出现激素紊乱表现〔1，2〕。现代医学对垂体瘤的治疗多采取手术、放疗以及药物治疗等方法，但手术容易对大脑中其他重要组织造成副损伤，引起手术并发症，放疗以及药物治疗副反应较多，严重降低患者生活质量〔3〕。垂体腺瘤的病变机制目前尚未完全明确。研究发现〔4〕，微小RNA(miRNA)能够通过完全或不完全与靶RNA配对，阻止miRNA转录、翻译或者降解靶RNA，负向调节相关蛋白的表达，调节机体生长发育；若miRNA失衡表达，将会导致细胞的生长、发育、增殖、分化以及凋亡过程的紊乱，从而促使肿瘤的发生、发展甚至侵袭性生长。本研究通过观察垂体瘤细胞中增生细胞核抗原(ki-67)、垂体瘤转化基因(PTTG)、血管内皮生长因子(VEGF)基因及蛋白表达水平，探究miRNA对垂体腺瘤的影响。

1资料与方法

1.1材料标记的miRNA基因购于陕西钰堂生物科技发展有限公司；人垂体瘤细胞株购于中国医学科学院基础研究所；RPMI-1640培养基及Trizol试剂均购于购于美国GIBCO公司；RT-PCR试剂盒、超纯RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购于美国Promega公司；兔抗人ki-67抗体、兔抗人PTTG抗体、兔抗人VEGF抗体、引物、Tap酶和二氨基联苯胺(DAB)显色剂购于Cell Signalling Technology 公司。

1.2人垂体瘤细胞及人正常垂体细胞培养无菌操作下，取人垂体瘤细胞株置于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清和2%谷氨酰胺)中，在37℃体积分数为5%的CO2饱和湿度环境中培养，培养24 h至生长对数期，用0.25%胰酶消化细胞，10%体积分数的小牛血清培养基终止消化，按照1∶3传代培养，3 d传代培养1次。

预先置有玻片的24孔板内加入1 ml浓度为2×105/ml的人垂体瘤细胞悬液，置于37℃体积分数为5%的CO2饱和湿度环境中培养，24 h长成单层后，抽取并除去上清液，在适宜环境中培养2 h后，除去上清液，并加入适量的RPMI-1640培养基继续培养。培养24 h后取出玻片，采用苏木素染色成功，于光学显微镜下观察。见图1。

图1　PTTG、VEGF、ki-67在人垂体瘤细胞中的阳性表达(×400)

向预先准备好的A、B两个50 cm3培养瓶中分别加入浓度为2×105/ml的人垂体瘤细胞悬液10 ml，置于37℃体积分数为5%的CO2饱和湿度环境中培养，24 h长成单层后，抽取并除去上清液，除去上清液，培养24 h后，向A培养瓶加入2 μl标记的miRNA基因，向B培养瓶加入等量RPMI-1640培养基，置于适宜环境中继续培养，分别取培养24 h后细胞备用。

1.3RT-PCR法检测人垂体瘤细胞中ki-67、PTTG、VEGF基因表达水平

1.3.1总RNA的提取分别取A、B两培养瓶人垂体瘤细胞置于0.2%胶原酶中消化，采用D-Hank液清洗，4℃冰浴30 min，1 200 r/min离心8 min，制备成单细胞沉淀，向单细胞沉淀中加入1 ml Trizol试剂，采用超纯RNA提取试剂盒提取人垂体瘤细胞中总RNA。实验操作按产品说明书进行，用紫外分光光度法测定RNA的OD260/OD280确定总RNA纯度。

1.3.2反转录聚合酶链反应根据逆转录试剂盒要求进行反转录反应操作，按照相关文献资料设计聚合酶链反应(PCR)中内参照ki-67、PTTG、VEGF和β-actin引物，将RNA模板、引物、5×RT Buffer 和RNase-free水溶解并置于冰上备用，将2 μl Primer mix试剂和10 μl消化后RNA分别加入20 μl反应体系的第一部分，混匀。PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μl，PCR正义引物(10 μmol/L)0.4 μl，PCR正义引物(10 μmol/L)0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA模板2 μl，dH2O 6.8 μl，总反应体系为20 μl。经过PCR反应条件的优化,PCR循环条件为94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,共35个循环,最后72℃再延伸5 min。引物序列见表1。

表1目的基因的实时定量RT-PCR引物序列

引物名称引物序列(5'-3')产物大小(bp)ki-67正义CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA747ki-67反义ACACTCCAGCTGGGAGCTGGTGTTGTPTTG正义GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT645PTTG反义TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGCVEGF正义CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA524VEGF反义ACACTCCAGCTGGGTAGGCAGTGTCAβ-actin正义CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA519β-actin反义ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGAC

1.3.3结果观察PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,溴乙啶染色，通过成像分析scion软件计算和比较ki-67、PTTG和VEGF产物条带的吸光度值，并与β-actin条带光密度值比较，计算出ki-67、PTTG和VEGF在人垂体瘤细胞中mRNA表达含量相对值。

1.4Western印迹法检测人垂体瘤细胞中ki-67、PTTG和VEGF表达无菌操作下，分别取A、B两培养瓶人垂体瘤细胞，将选取好的人垂体瘤细胞经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，洗涤后离心收集，用冰冷PBS洗涤细胞3次后，加入裂解缓冲液，摇匀，4℃冰浴30 min，1 200 r/min离心10 min，吸取上清液，即胞质蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)法对样品蛋白质进行蛋白定量。调整样品蛋白量为30～40 μg后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，并将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PBS洗膜5 min后，PBS溶解封闭PVDF 2 h。继而加入兔抗人ki-67抗体、兔抗人PTTG抗体、兔抗人VEGF抗体(1∶1 000稀释)或抗β-actin(1∶2 000稀释)，置于4℃环境中过夜。PBS洗涤3次，10 min/次，加入二抗，温室孵育2 h。再次用PBS洗涤3次，10 min/次。将PVDF膜增强化学发光法(ECL)显色，在暗室中将PVDF曝光于X光片中，用凝胶成像系统扫描分析结果。

1.5统计学方法应用SPSS17.0统计学分析软件，组间比较进行t检验。

2结果

2.1总RNA提取结果紫外分光光度法测定中可知人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF总RNA OD260/OD280值在1.8～2.0之间，在1.2%的琼脂糖凝胶电泳可观察到28 S、18 S、5 S三条产物条带，说明提取人垂体瘤细胞中的总RNA完整性较好。

2.2A、B两个培养瓶中人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF mRNA表达比较A培养瓶加标记的miRNA基因后培养24 h，人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF mRNA表达水平(0.41±0.11，0.38±0.13，0.34±0.06)明显低于B培养瓶(0.66±0.05，0.71±0.12，0.69±0.11)(P<0.05)。见图2。

2.3A、B两个培养瓶中人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF蛋白表达比较A培养瓶加入miRNA基因后培养24 h，人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF蛋白表达水平(0.37±0.13，0.41±0.09，0.32±0.07)明显低于B培养瓶(0.56±0.12，0.61±0.11，0.62±0.13)(P<0.05)。见图3。

图2　人垂体瘤细胞ki-67、PTTG和VEGF PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图

图3　人垂体瘤细胞中ki-67、PTTG和VEGF 编码蛋白表达结果图

3讨论

垂体瘤是良性垂体前叶肿瘤，是颅内生长较缓慢的常见肿瘤，肿瘤直径<1 cm，生长限于鞍内者为微腺瘤，除影像学外还需血清内分泌素含量测定确诊；直径>1 cm并已超越鞍膈者为大腺瘤；肿瘤直径>3 cm者为巨腺瘤〔5～7〕。微腺瘤和大腺瘤临床主要以内分泌症状表现为主，而巨腺瘤表现为内分泌症状之外还有压迫视神经及高颅内压症状〔8〕。垂体瘤的发病机制是多种因素共同参与、病理生理十分复杂，目前尚未有明确的发病机制。垂体腺瘤虽为良性肿瘤，但是由于颅内结构特殊，手术很难做到完全切除，极易复发，放疗以及药物治疗效果亦不明显〔9〕。研究发现〔10〕，miRNA是一类动植物中的基因表达调控因子，作用于肿瘤相关的脆性位点，对癌基因产生抑制作用，与肿瘤的发生有着密切的关系。

本研究结果说明miRNA通过抑制垂体细胞中ki-67、PTTG、VEGF的表达，抑制肿瘤细胞的生长，削弱肿瘤细胞的侵袭性，有效抑制癌基因，从而阻止垂体肿瘤的发生、发生甚至浸润。VEGF〔11〕是迄今为止最重要的血管形成因子，垂体腺瘤的发生、发展、浸润依赖新生血管的形成和营养供应，垂体腺瘤新生血管的形成依靠VEGF的作用，垂体腺瘤是血运丰富的肿瘤，其的不断、快速的增长从而促使机体分泌大量的VEGF〔12〕。垂体腺瘤的生长还需PTTG通过血管活性物质来促进，碱性成纤维细胞生长因子是PTTG促进垂体腺瘤生长的主要血管活性物质〔13〕。研究发现〔14〕，通过上调垂体瘤组织中PTTG生长因子受体，其VFGE表达水平亦随之增高，说明VEGF和PTTG共同促进垂体腺瘤血管的形成，从而促进垂体腺瘤的生长和浸润。ki-67〔14〕为一种细胞核抗原蛋白，主要存在于增殖细胞核内，在细胞有丝分裂的M期呈现表达高峰，然而不在G0期细胞中表达。ki-67半衰期短，在DNA修复状态的细胞中不表达，能够反映出细胞增殖活性、肿瘤细胞的生长方式和复发等生物学行为，也能够作为肿瘤预后的标志。miRNA能够通过完全或不完全与靶RNA配对，阻止miRNA转录、翻译或者降解靶RNA，负向调节相关蛋白的表达，调节细胞生长、发育、凋亡过程〔15〕。相关研究表明〔15〕，垂体腺瘤细胞中miRNA处于低水平表达，无法抑制癌基因的表达，导致垂体腺瘤细胞无限期增长，从而使机体分泌大量的PTTG、VEGF和ki-67。

综上所述，miRNA能够调节细胞的生长、发育和凋亡的过程，抑制癌细胞的表达，从而降低垂体瘤细胞中PTTG、VEGF和ki-67的表达，有利于提高临床对垂体腺瘤的治疗疗效，改善患者生活质量，对临床实际应用具有重要的指导意义。

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〔2015-02-09修回〕

(编辑袁左鸣)

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中图分类号〔〕R739.41〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7033-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.029