电针对非酒精性脂肪肝大鼠细胞角蛋白18表达的影响

蒋　娟　黄学宽　朱　丹　曾志华　骆　言　张超男

(重庆医科大学中医药学院，重庆　401331)



电针对非酒精性脂肪肝大鼠细胞角蛋白18表达的影响

蒋娟黄学宽朱丹曾志华骆言张超男

(重庆医科大学中医药学院，重庆401331)

摘要〔〕目的观察电针对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠细胞角蛋白18(CK18)变化的调节规律，探究其作用机制。方法取SD大鼠44只，雌性，体质量(180±20)g，将大鼠随机分为正常组、模型组、东宝肝泰组、电针组，每组11只。正常组食用标准饲料，其余各组均采用高脂高胆固醇(TC)饲料(含2%胆固醇、10%猪油及88%基础饲料)喂养8 w。造模成功后，东宝肝泰组按0.9 g/kg体重灌服，1次/d，共治疗28 d；电针组针刺 “肝俞”、“脾俞”、“膈俞”穴，电压9 V，电流强度1～3 mA，频率为1.5～2 Hz，疏密波，留针15 min，1次/d，连续28 d。应用酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫组化法分别检测各组大鼠血清及肝组织CK18的变化。结果ELISA和免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组CK18含量与表达均上调(P<0.05)，电针组与东宝肝泰组CK18含量与表达均较模型组下调(P<0.05)，且电针组明显优于东宝肝泰组(P<0.05)。结论电针干预可显著抑制NAFCD模型大鼠CK18含量和表达的上调趋势，对缓解NAFLD肝细胞进一步发展，减轻肝脏负荷具有重要作用。

关键词〔〕电针；非酒精性脂肪肝；细胞角蛋白18

第一作者：蒋娟(1987-)，女，2011级在读硕士，主要从事针灸理论及临床研究。

非酒精性脂肪肝(NAFLD) 是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪性变和脂肪存积为特征的临床病理综合征，其发病机制至今尚未完全明确。因脂肪肝可使肝细胞坏死，进一步演变为肝纤维化、肝硬化，故早期诊治以防止其发展至关重要。而细胞角蛋白(CK)18作为一种从凋亡肝细胞中释放出来的蛋白，与肝脏损伤关系十分密切。本实验检测电针对NAFLD大鼠CK18含量及表达的影响，探讨电针治疗NAFLD的作用机制。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器总胆固醇(TC)(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：13K10350)；东宝肝泰(通化东宝药业股份有限公司，国药准字H22024764，批号：20120411)；CK18酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20121009)；CK18抗体(北京博奥森生物技术公司，批号：20121203)；电针综合治疗仪(重庆医疗器械厂制造)；80-2型低速离心机(上海手术器械厂)；酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS 352型)；洗板机(芬兰Thermo Labsystems AC8)；显微镜(日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11)；多功能真彩色细胞图像分析处理系统(美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus)；恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型)等。

1.2实验分组与模型复制清洁级雌性SD大鼠44只，体质量(180±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供(动物批号：SCXK渝2007-0001)，大鼠自由摄食和饮水，适应性喂养1 w后，随机分为正常组11只和模型组、东宝肝泰组和电针组，每组11只，正常组食用标准饲料，造模大鼠以高脂高TC饲料〔1〕(即含2%胆固醇、10%猪油及88%基饲饲料)制造NAFLD模型，喂养8 w。造模第8周末，随机抽取正常组大鼠1只和造模大鼠3只(分别从模型组、东宝肝泰组和电针组各抽取1只)，处死，取肝脏进行病理切片证实脂肪肝已形成，说明造模成功。

1.3治疗方法东宝肝泰组：大鼠灌胃东宝肝泰溶液，按0.9 g/kg体重灌服，1次/d，连续28 d。电针组：以调肝健脾、化痰活血为法，电针时将大鼠放置于大鼠固定器中，大鼠腧穴根据《实验针灸学》定位〔2〕，取双侧肝俞、脾俞、膈俞，用32#毫针，分别刺入1～7 mm深度，接通电针综合治疗仪，频率为电压9 V，电流强度1～3 mA，1.5～2 Hz，疏密波，以大鼠躯干轻微抖动为度，保持大鼠状态清醒，1次/d，每次15 min，连续治疗28 d。正常组和模型组每天放入大鼠固定器中15 min，不作其他处理，共28 d。

1.4指标检测在末次治疗后禁食24 h，摘取大鼠眼球取血，静置30 min，低温离心机3 000 r/min离心15 min，取上清液，4℃保存待测。颈椎脱臼处死大鼠，及时打开腹腔，取肝脏左叶相同部位大小肝组织放入10%甲醛中固定，石蜡包埋，切片，染色，光学显微镜下拍照。CK18酶联免疫吸附法(ELLSA)检测血清，按照试剂盒说明进行操作；CK18免疫组化法检测肝组织，按照SP试剂盒操作，每张切片最少10个高倍视野，光镜400倍下观察。应用多功能真彩色细胞图像分析处理系统对CK18的蛋白表达进行分析，胞质棕褐色为阳性反应，用阳性细胞面积来标示表达强度。

1.5统计学处理采用SPSS18.0软件行t检验。

2结果

2.1大鼠血清CK18含量的比较与正常组(227 pl)比较，模型组大鼠血清CK18的含量显著升高(588 pl，P<0.05)；与模型组比较，东宝肝泰组和电针组血清CK18的含量显著降低(410 pl,P<0.05)；但电针组(309 pl)对NAFLD模型大鼠血清CK18含量的影响明显优于东宝肝泰组(P<0.05)。

2.2大鼠肝组织免疫组化法CK18表达的比较CK18免疫组化显示阳性细胞为棕黄色颗粒，在高倍显微镜下观察每个视野内阳性细胞率，并对图片阳性区域进行累积光密度值(IOD)测定。结果发现，模型组IOD值显著高于正常组(P<0.05)，为强阳性表达；电针组和东宝肝泰组IOD值显著低于模型组(P<0.05)，且电针组IOD值低于东宝肝泰组(P<0.05)，可见电针组为弱阳性表达，东宝肝泰组为阳性表达。见表1、图1。

组别阳性细胞率(%)阳性细胞显示强度IOD正常组0.711.2±0.31)模型组533171.5±15.5东宝肝泰组26369.3±6.21)2)电针组10131.5±4.91)

与模型组比较：1)P<0.05；与电针组比较：2)P<0.05

图1　大鼠肝组织免疫组化法CK18的表达(SP法，×400)

3讨论

NAFLD发生的主要原因是脂类代谢障碍，其发病机制较为复杂，至今尚未完全阐明。本病在脂肪变性的基础上常伴有肝细胞变性坏死和炎症细胞浸润，而炎症应答主要在脂肪组织和肝脏中存在〔3〕，可见小叶内炎症、汇管区炎症、汇管区变性及点状坏死或坏死灶。目前NAFLD的发生和发展可用“两次打击”的理论解释〔4〕，NAFLD因为肝内脂类代谢不平衡引起的胰岛素抵抗(IR)而导致第1次打击。IR完成后，其受体通过自身磷酸化激活下游的(MAPK)通路和其相关核内转录因子，使炎症因子和活性氧自由基得以释放，炎症因子反应过多，造成第二次打击，从而加重NAFLD〔5〕。

CK18 是肝细胞膜骨架重要的组成部分，主要表达于成熟上皮细胞的中间丝蛋(IFP)。CK18主要保护肝细胞不受到机械性和非机械性导致的各种压力，一般认为CK18是肝细胞凋亡和坏死过程中的一种相对特异蛋白，可在肝脏受到损害时起到“监察”作用〔6〕，从而防止肝脏受到进一步损害。CK18在肝病领域的意义主要在于识别轻微的肝脏损伤，转氨酶甚至在正常范围内的轻微肝损。研究表明，通过ELISA法检测血清中CK18水平能较准确地反映肝脏病理变化〔7〕。可见电针能调节NAFLD模型大鼠血清CK18含量和肝组织CK18的表达，也是研究NAFLD的新思路和新方法。

有文献发现雌性大鼠比雄性大鼠更容易受到NAFLD的损伤，故选择雌性大鼠作为本实验的研究对象〔8〕。而针灸是通过整体调节和双向调节作用，以达到扶正祛邪、疏通经络以协调阴阳之目的。有研究对150例NAFLD肝患者进行多因素Logistic回归分析，发现体重指数(BMI)、TG、空腹血糖(FBG)、(DBP)是NAFLD的独立危险因素，认为NAFLD以肝气郁滞型、湿热内蕴型、痰湿内阻型、瘀血阻滞型、肝肾阴虚型五种症候为主，其主要独立危险因素为BMI、TG、FBG、DBP〔9〕。而应用肝脾相关理论治疗NAFLD肝纤维化以提高临床疗效，认为其作用机制之一可能与通过调节瘦素、脂质代谢功能有关〔10〕。也有人认为，痰瘀阻络是NAFLD形成的基本病机〔11〕。因此，痰瘀互结、肝脾失调应是NAFLD形成的主要原因，通过针刺则可调节炎症因子的表达以促进脂代谢〔12〕。本实验通过电针“肝俞”、“脾俞”、“膈俞”而达到消痰化瘀、健脾疏肝等作用。其中肝俞穴具有行气疏肝的功效，《素问》“从阴引阳，从阳引阴”，因脏病为阴病，背俞穴位于阳位，采用俞治脏病；脾俞健脾化湿，可增强胃肠蠕动，并能提高多种消化酶的活力，帮助消化以降低血脂、血液黏度；膈俞具有宽胸理气、活血通络的作用，能降低血液黏滞度，使血流加速，改善微循环。

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〔2014-06-11修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：黄学宽(1972-)，男，教授，硕士生导师，主要从事中医经络理论及临床研究。

基金项目：重庆市卫生局科技资助项目(2011-2-146)

中图分类号〔〕R575.5〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6708-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.027