高果糖、高脂喂养致小鼠肝脏内质网应激的时程变化

任路平　于　贤　宋光耀　孙　文　李　凡　陈树春

(河北省人民医院内分泌一科，河北　石家庄　050000)



高果糖、高脂喂养致小鼠肝脏内质网应激的时程变化

任路平于贤宋光耀孙文李凡陈树春

(河北省人民医院内分泌一科，河北石家庄050000)

摘要〔〕目的探讨高果糖与高脂饮食对比诱导的小鼠肝脏内质网应激(ERS)的发生时程变化。方法雄性C57BL/J6小鼠分为对照组、高果糖组及高脂组，分别在喂养3 d、8 w后测定各组小鼠空腹血糖(FPG)、空腹血清胰岛素(FINS)、肝脏甘油三酯(TG)含量，并测定各组小鼠肝脏ERS标志物——磷酸化胰腺内质网激酶(p-PERK)及磷酸化山梨醇要求激酶-1(p-IRE1/t-IRE1)的蛋白表达。结果喂养3 d后，与对照组相比，两组FPG、FINS无明显变化，而肝TG水平均显著增加；喂养8 w后，与对照组相比，两组FPG、FINS、肝TG水平均显著增加；喂养3 d后，与对照组相比，高果糖组的肝内p-PERK、p-IRE1蛋白表达显著增加，提示出现ERS，而高脂组GRP78、p-PERK的蛋白表达与对照组无显著区别；喂养8 w后，高果糖、高脂组的肝内p-PERK、p-IRE1蛋白表达均显著增加。结论短期和长期高果糖和高脂喂养均可引起肝内脂质沉积，但高果糖喂养小鼠在脂肪肝发生早期即可出现肝ERS，而高脂喂养小鼠则在长期喂养后方出现肝ERS，提示ERS与高果糖、高脂饮食诱导的脂肪肝发生发展均有关，但介导机制不同。

关键词〔〕甘油三酯；脂肪肝；内质网应激

第一作者：任路平(1977-)，女，副主任医师，硕士生导师，主要从事内分泌脂代谢学研究。

果糖和脂类是引起肝内脂肪沉积的两个重要的饮食因素，啮齿类的动物实验发现，不同时期的果糖、脂类的过量摄入(短期及长期喂养)均可引起肝内甘油三酯(TG)等脂质沉积〔1,2〕。研究表明，肝脏内质网应激(ERS)可能参与了脂肪肝的发生发展〔3〕。然而，尚无研究比较两种不同饮食因素诱导脂肪肝的发生时期与ERS的关系。本研究旨在进一步探讨ERS在饮食诱导脂肪肝中的介导作用。

1材料和方法

1.1模型建立成年雄性C57BL/J6小鼠按随机数字表随机分为对照组、高果糖组及高脂组，每组30只，体重24～27 g。对照组进食普通饲料(淀粉69%，脂肪10%，蛋白质21%)；高果糖组饲料配方：淀粉34.5%，果糖34.5%，脂肪9%，蛋白质21%；高脂组饲料配方：淀粉20%，脂肪59%，蛋白质21%。三组小鼠每日进食热量基本相等，于喂养3 d后行相关指标测定，并每组处死15只小鼠，留取肝脏组织；余小鼠继续喂养至8 w后行相关指标测定，处死小鼠，留取肝脏组织。

1.2检测指标及方法

1.2.1血清指标测定各组小鼠于不同时期自尾尖取血，分离血清，空腹血糖(FPG)采用快速血糖测定仪测定；空腹血清胰岛素(FINS)采用放射免疫法测定。

1.2.2肝脏TG测定取肝脏组织20～30 mg，经氯仿/甲醇抽提TG后，应用TG检验测试试剂盒(GPO-PAP)测定TG含量。

1.2.3Western印迹法测定蛋白含量每组随机选6例样本进行蛋白表达分析。取肝组织30 mg加入RIPA 裂解液制成匀浆，用低温离心机13 000 r/min离心5 min，取20 μg蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭后加入1∶1 000稀释的抗体，单抗4℃孵育过夜；加入1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，增强化学发光法(ECL)Plus 发光显色，X线底片压片、显像。内参抗体Pan14-3-3。用IMAGEJ软件分析目的蛋白表达相对含量。磷酸化胰腺内质网激酶(p-PERK)抗体由cell signaling公司提供(#3191)，磷酸化山梨醇要求激酶-1(p-IRE-1)抗体、总IRE-1抗体、Pan14-3-3由ABCAM公司提供(ab48187，ab48189，ab12341)。

1.3统计学方法应用SPSS11.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1实验3 d、8 w后各组小鼠指标检测结果各组小鼠实验起始体重无差异，喂养3 d后，不同饲料体重增长无明显区别，高果糖组、高脂组的FBG、FINS与对照组比较无差异(P>0.05)，喂养8 w后，各组小鼠体重增长无明显区别，但高果糖组、高脂组的FBG、FINS均显著高于对照组，高果糖组、 高脂组之间无显著区别。实验3 d、8 w后，与对照组相比，高果糖组、高脂组的肝脏TG水平均显著增高(P均<0.01)，其中高果糖组高于高脂组(P<0.01)。见表1。

组别体重(g)FPG(mmol/L)FINS(nmol/L)肝脏TG(μmol/g)3d对照组25.1±0.45.9±0.30.18±0.0410.65±0.54 高果糖组25.4±0.66.1±0.50.19±0.0326.28±0.671 高脂组 25.3±0.76.0±0.40.19±0.0524.69±0.991)2)组别体重(g)FPG(mmol/L)FINS(nmol/L)肝脏TG(μmol/g)8w对照组28.9±0.66.4±0.40.23±0.0713.72±0.67 高果糖组29.1±0.87.6±0.41)0.38±0.041)30.82±1.761) 高脂组 29.2±0.97.5±0.51)0.35±0.061)29.56±1.531)

与对照组比较：1)P<0.01;与高果糖组比较：2)P<0.05

2.2各组肝脏ERS标志物表达情况喂养3 d后，与对照组相比，高果糖组反映ERS的p-PERK、p-IRE1/t-IRE1蛋白表达明显增加(P均<0.01)，而高脂组与对照组无显著差别(P均>0.05)(图1)。喂养8 w后，与对照组相比，高果糖组、高脂组的p-PERK、p-IRE1/t-IRE1的蛋白表达均明显增加(P<0.01)(图2)。

图1　喂养3 d后各组肝脏ERS标志物表达情况

图2　喂养8 w后各组肝脏ERS标志物表达情况

3讨论

关于饮食摄取的流行病学研究表明，脂类和果糖的过量摄入与非酒精性脂肪肝的发生发展相关〔4,5〕。既往研究表明，短期(喂养3 d或1 w)的脂类、果糖过量摄入即可引起肝细胞内脂质沉积〔1,6〕，本研究结果和既往研究结果一致，高果糖、高脂喂养3 d后即出现肝细胞内TG含量升高；同时，在喂养8 w后，高果糖、高脂饮食喂养小鼠均存在持续的肝脏脂质沉积。通过短期、长期的两种饮食喂养，本研究证实了果糖、脂类的过量摄入对肝细胞脂质代谢的危害。

肝细胞具有多种合成代谢的功能，而内质网是多功能的细胞器，特别是在肝细胞内，内质网负责合成脂类，也加工各种蛋白包括脂肪合成酶类，对能量代谢的变化很敏感。近年，ERS在肝脏疾病发生发展中的作用被认识到。不同角度的研究发现，ERS与脂肪肝的发生发展有密切关系。以往研究发现，在ob/ob小鼠(遗传性肥胖)和长期高脂喂养的啮齿类动物模型中，随着脂肪肝的出现，亦伴有肝内ERS〔3〕；而4-苯基丁酸(4-PBA)可通过抑制ERS减轻ob/ob小鼠内的肝脏TG含量〔7〕。前期研究也发现长期高果糖喂养可在诱导小鼠脂肪肝的同时诱导肝脏出现ERS〔2〕。但是，目前尚无研究比较不同时期高果糖、高脂饮食诱导脂肪肝中ERS的时程变化。本研究结果提示，ERS贯穿了高果糖饮食诱导的脂肪肝的发生发展的始终，而仅仅出现在高脂喂养诱导的肝脏脂质合成的后期。这种不一致的时程变化提示ERS在两种饮食介导的脂肪肝中可能发挥着不同的介导作用。内质网具有复杂的功能，分子学研究表明，ERS不仅可通过刺激脂质合成促进肝脏脂质堆积及脂肪肝的早期发生，同时可参与脂肪肝发展后期的氧化应激、细胞凋亡等事件〔3〕。ERS在两种饮食中的不同时程改变可能与果糖、脂类通过不同机制诱导肝细胞脂质沉积有关。首先，果糖作为一个强烈的刺激肝脏脂质从头合成的饮食因子，可促进脂质合成上游因子(如SREBP-1，ChREBP等)的上调，继而促进脂质合成关键酶的表达增加，引起内源性脂质合成增多而致肝细胞内TG等脂质堆积。本课题组前期研究表明，3 d及8 w果糖过量摄入后，啮齿类动物肝脏内的脂质合成相关酶类，包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰CoA脱饱和酶(SCD)-1和脂肪酸合成酶(FAS)的蛋白表达均显著上调〔2,6〕，提示脂质从头合成增强是短期、长期高果糖喂养引起脂肪肝的重要机制之一。不同的分子生物学研究表明，ERS中的非折叠蛋白反应(UPR)通路可刺激脂质从头合成，目前认为UPR的PERK-eIF2α和IRE-1-XBP-1通路介导了的脂质从头合成。一个转基因小鼠模型通过减少eIF2α的磷酸化抑制了PERK-eIF2α通路的激活，发现PERK-eIF2α通路的抑制可减轻高脂饮食诱导的小鼠肝内脂质沉积，揭示了此条UPR通路具有调节肝脏脂质合成的作用〔8〕；一个XBP-1基因敲除小鼠模型的研究发现，XBP-1基因可调控SCD-1和ACC2的表达，从而影响了脂质代谢，XBP-1基因实际上是调控肝脏脂质从头合成的一个新的上游转录因子〔9〕；另外，在ob/ob小鼠中，ERS伴侣分子GRP78的过表达可促进脂质合成上游转录因子SREBP-1c的活化，从而促进SREBP-1c靶基因表达的上调〔10〕。这些研究均提示ERS通过影响肝脏内源性的脂质合成而介导了脂肪肝的发生。高果糖喂养3 d后，小鼠肝内ERS可能通过刺激肝内脂质从头合成参与了果糖诱导脂肪肝的始动发生环节。

与此相反，高脂喂养通过不同的机制引起脂肪肝。由于高脂饮食(棕榈酸为主要成分)中提供了机体需要量以外的过多的外源性脂质，流入肝脏的外源性饱和脂肪酸增多，刺激了甘油磷酸脂酰转移酶(GPAT)活化，GPAT的活化进一步使TG和脂蛋白的合成增加，导致了肝细胞内脂质的沉积而引起脂肪肝〔11〕。既往研究表明，与高果糖喂养相反，高脂喂养小鼠肝细胞内ACC、FAS和SCD-1的蛋白表达均下调，原因是过多的外源性脂肪酸抑制了肝内源性脂质从头合成通路〔1,2〕。因此，这可能解释了本研究中ERS未出现于短期高脂喂养小鼠脂肪肝的原因，提示在高脂喂养小鼠中，肝脏脂质沉积早于ERS的出现，ERS并未介导高脂饮食诱导的脂肪肝的早期发生。同时，本研究结果表明，长期高脂喂养后小鼠肝内出现了ERS，支持了ERS在高脂喂养脂肪肝后期发展中的介导作用。在脂肪肝持续存在的过程中，肝细胞内过量的脂质负荷活化了ERS，引起了UPR，持久的UPR及持续的ERS则会诱导细胞凋亡、组织炎症及坏死，参与了脂肪肝的后期发展〔12〕。

ERS在果糖、脂类所诱导的脂肪肝中发挥了不同的作用。两种不同饮食因子在不同时期诱发了肝脏ERS，ERS介导了果糖过量摄入所诱导的脂肪肝早期的发生发展，ERS可能是果糖诱导脂肪肝的始动因素之一；而ERS不是高脂饮食诱导的脂肪肝的早期细胞事件，而发生于肝脂质合成发生后期，提示ERS并不是脂类诱导脂肪肝的始动因素，而可能参与了脂肪肝后期所出现炎症、氧化应激等细胞事件；具体机制还需进一步深入的分子生物学研究。

参考文献4

1Ren LP，Chan SM，Zeng XY，etal.Differing endoplasmic reticulum stress response to excess lipogenesis versus lipid oversupply in relation to hepatic steatosis and insulin resistance〔J〕.PLoS One，2012；7(2)：30816.

2任路平，刘娜，宋光耀，等.高果糖、高脂饲料喂养小鼠肝脏脂质合成酶类与内质网应激相关因子蛋白表达变化〔J〕.中华消化杂志，2011；31(10)：686-9.

3Ozcan U，Cao Q，Yilmaz E，etal.Endoplasmic reticulum stress links obesity，insulin action，and type 2 diabetes〔J〕.Science，2004；306(5695)：457-61.

4Moore JB.Non-alcoholic fatty liver disease：the hepatic consequence of obesity and the metabolic syndrome〔J〕.Proc Nutr Soc，2010；69(2)：211-20.

5Sullivan JS，Le MT，Pan Z，etal.Oral fructose absorption in obese children with non-alcoholic fatty liver disease〔J〕.Pediatr Obes，2014;〔Epud ahead of print〕.

6任路平，宋光耀，章冬梅，等.短期高果糖喂养对小鼠肝脏脂质沉积和肝胰岛素敏感性的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2011；27(12)：2286-90.

7Ozcan U，Yilmaz E，Ozcan L，etal.Chemical chaperones reduce ER stress and restore glucose homeostasis in a mouse model of type 2 diabetes〔J〕.Science，2006；313(5790)：1137-40.

8Oyadomari S，Harding HP，Zhang Y，etal.Dephosphorylation of translation initiation factor 2alpha enhances glucose tolerance and attenuates hepatosteatosis in mice〔J〕.Cell Metab，2008；7(6)：520-32.

9Lee S，Spencer ND.Materials science.Sweet，hairy，soft，and slippery〔J〕.Science，2008；319(5863)：575-6.

10Kammoun HL，Chabanon H，Hainault I，etal.GRP78 expression inhibits insulin and ER stress-induced SREBP-1c activation and reduces hepatic steatosis in mice〔J〕.J Clin Invest，2009；119(5)：1201-15.

11Julius U.Influence of plasma free fatty acids on lipoprotein synthesis and diabetic dyslipidemia〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2003；111(5)：246-50.

12Ren LP，Song GY，Hu ZJ，etal.The chemical chaperon 4-phenylbutyric acid ameliorates hepatic steatosis through inhibition of de novo lipogenesis in high-fructose-fed rats〔J〕.Int J Mol Med，2013；32(5)：1029-36.

〔2014-11-25修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：宋光耀(1958-)，男，主任医师，博士生导师，主要从事内分泌脂代谢学研究。

基金项目：国家自然基金资助项目(No.81200639)

中图分类号〔〕R333.4〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6694-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.020