脑梗死大鼠脑组织载脂蛋白A1、B、脑源性神经营养因子的表达和神经功能的变化

李晓斌　王晓雪　徐宏侠　刘欣欣

(开封市中心医院神经内科，河南　开封　475003)



脑梗死大鼠脑组织载脂蛋白A1、B、脑源性神经营养因子的表达和神经功能的变化

李晓斌王晓雪1徐宏侠1刘欣欣1

(开封市中心医院神经内科，河南开封475003)

摘要〔〕目的探究脑梗死大鼠脑组织载脂蛋白(Apo)A1、ApoB、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达和神经功能变化。方法SPF级SD雄性大鼠50只，随机分为对照组、脑梗死1 d组、脑梗死3 d组、脑梗死1 w组和脑梗死2 w组。线栓法(MCAO)建立脑梗死动物模型。mNSS评分表评价各组大鼠神经功能变化，取大鼠脑组织进行HE染色观察大鼠脑梗死后大脑组织损伤情况和计算梗死面积，免疫组化半定量法检测大鼠大脑组织ApoA1、ApoB和BDNF的表达情况。结果脑梗死大鼠存活率降低；大鼠神经功能mNSS评分随着梗死时间延长显著降低(P<0.05)；HE染色显示随着梗死时间延长大鼠大脑细胞排列混乱、细胞核轮廓模糊、小胶质细胞数量明显增多，脑梗死面积也越来越大；大鼠大脑组织ApoA1、ApoB和BDNF免疫组化显示，ApoA1的表达随着脑梗死时间延长显著降低(P<0.05)，ApoB的表达随着脑梗死时间延长显著升高(P<0.05)，BDNF的表达在脑梗死1 d后显著升高(P<0.05)，然后随时间延长而下降(P<0.05)。结论脑梗死1 d后BDNF表达显著增加是大脑一种自我代偿机制，脑梗死后ApoA1表达减少、ApoB表达增加、BDNF表达减少很可能是导致脑梗死后大脑组织损伤加重和梗死面积增加的原因之一。

关键词〔〕脑梗死;载脂蛋白A1;载脂蛋白B;脑源性神经营养因子;神经功能

1河南大学第一附属医院神经内科

第一作者：李晓斌(1972-)，男，主治医师，主要从事脑血管病研究。

脑梗死是临床常见的一种因供血不足而引起的大脑组织缺血性坏死的脑血管疾病〔1〕。高发于中老年群体，尤其是伴随高血脂动脉硬化患者、高血压患者等〔2〕。研究发现随着我国人口老龄化趋势严峻，脑梗死的发病率有逐年上升趋势〔3〕。脑梗死因其具有很高的致死率和致残率，严重影响患者预后的生活质量。研究发现血脂代谢异常是脑梗死发病的高危险因素〔4,5〕。载脂蛋白(Apo)A1和ApoB分别是高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的主要结构蛋白，其表达水平将反映机体血脂代谢情况〔6,7〕；脑源性神经营养因子(BDNF)是一种内源性神经生长因子，其对神经系统损伤具有修复和保护作用〔8〕。本文探讨脑梗死后大鼠脑组织载脂蛋白、BDNF的表达和神经功能的变化。

1材料和方法

1.1主要试剂及仪器苏木素和曙红Y试剂购自国药集团化学试剂有限公司。大鼠ApoA1、ApoB和BDNF一抗购自Sigma-Aldrich公司，大鼠ApoA1、ApoB和BDNF二抗购自Abcam公司。SP免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2实验动物及分组取体重在240～260 g之间的SPF级SD雄性大鼠50只，由北京大学实验动物中心提供，昼夜节律1 d。随机取大鼠10只作为对照组，其余40只大鼠禁食不禁水12 h后给予乙醚麻醉，然后线栓法制作大鼠脑梗死(MCAO)动物模型。大鼠仰卧固定，充分暴露颈部皮肤，常规消毒后，打开颈部皮肤分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉远心端，再在颈总动脉近心端和颈内动脉远心端放置动脉夹阻断血流。在颈外动脉结扎出剪断并插入栓线直至颈内动脉处，打开颈内动脉夹，继续推进栓线至遇阻力，阻断大脑中动脉血流后将栓线深插入18～20 mm，固定栓线缝合皮肤。2 h后再次乙醚麻醉，拔出栓线，缝合伤口，常规消毒。造模后给予大鼠常规抗感染护理、自由摄食和水。将MCAO大鼠随机分为脑梗死1 d组(大鼠造模后1 d，10只)、脑梗死3 d组(大鼠造模后3 d，10只)、脑梗死1 w组(大鼠造模后1 w，10只)和脑梗死2 w组(大鼠造模后2 w，10只)。

1.3脑梗死大鼠神经功能mNSS评分参照文献方法，对对照组大鼠、MCAO大鼠造模后1 d、3 d、1 w和2 w进行运动、感觉、平衡木和反射活动四个方面的神经功能mNSS评分，评分满分为18分。

1.4脑梗死大鼠脑组织的HE染色分别在造模后1 d、3 d、1 w和2 w取对应组的MCAO模型大鼠乙醚麻醉后，固定于手术台上，心脏灌注生理盐水冲洗后灌注4%多聚甲醛固定，断头取脑，标本进行石蜡包埋后，经切片、甲醇固定、染色等步骤制备得HE染色切片，于显微镜下观察大鼠脑梗死后脑组织损伤情况与梗死面积。对照组大鼠用同等方法得到大脑组织石蜡块样品。每只大鼠随机选取5个视野计算脑梗死面积比，脑梗死面积比=视野下脑梗死面积/视野大脑组织总面积×100%。

1.5免疫组化法检测脑梗死大鼠大脑组织中ApoA1、ApoB和BDNF的表达取对照组大鼠大脑石蜡块和MCAO模型组大鼠石蜡块，经过修整后，于切片机上切得4 μm病理切片。实验中采用SP法，以PBS缓冲溶液作为一抗的阴性对照，进行ApoA1、ApoB和BDNF的免疫组化，实验操作按照SP试剂盒进行。用染色强度与出现阳性反应面积的百分率之间的乘积作为免疫组化半定量结果。随机选择5个视野进行镜检统计，具体如下：染色无色计为0分，浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，深棕色计为3分；出现阳性反应面积的百分率在10%以下计为1分，在10%～50%之间计为2分，在50%～75%之间计为3分，在75%以上计为4分；半定量结果以大于2计为阳性，否则阴性。

1.6统计学方法采用SPSS17.0软件进行t及χ2检验。

2结果

2.1大鼠MCAO脑梗死动物模型的建立大鼠MCAO脑梗死模型建立后，大鼠多表现为右前爪不能伸展或存在右侧转圈障碍。脑梗死1 d组大鼠存活10只、脑梗死3 d组大鼠存活8只，脑梗死1 w组大鼠存活7只，脑梗死2 w组大鼠存活7只，对照组大鼠存活10只。

2.2脑梗死大鼠神经功能mNSS评分与对照组大鼠mNSS评分(1.07分)比较，造模后各组大鼠mNSS评分均显著升高(P<0.05)；与脑梗死1 d组大鼠mNSS评分(13.84分)比较，脑梗死3 d组(9.77分)、脑梗死1 w组(7.02分)和脑梗死2 w组(4.93分)mNSS评分均明显降低(P<0.05)，且脑梗死大鼠有明显随着时间延长mNSS评分降低趋势。

2.3脑梗死大鼠脑组织HE染色与对照组大鼠大脑HE染色切片比较，脑梗死1 d后大鼠大脑组织变化最小，几无明显变化；脑梗死3 d后大鼠脑组织出现水肿，细胞排列较为紊乱，且星形胶质细胞分布较为分散；脑梗死后1 w后大脑细胞排列更为紊乱且细胞核仁较为模糊，出现大量小胶质细胞和噬神经细胞现象；脑梗死2 w后大鼠大脑细胞结构模糊，小胶质细胞数量显著性增多。见图1。大鼠脑梗死面积比有明显的随着梗死时间延长而增大的趋势。对照组0.55%，脑梗死1 d，3 d,1 w,2 w组分别为11.23%、14.09%、16.97%、25.88%。

2.4大鼠大脑组织ApoA1、ApoB和BDNF的表达镜检结果发现，ApoA1在对照组表达最多，在脑梗死2 w组表达最少，ApoA1明显表现出随脑梗死时间延长而减少趋势；ApoB在对照组表达最少，而在脑梗死2 w组表达最多，ApoB明显表现出随脑梗死时间延长而增大趋势；BNDF在对照组和脑梗死2 w组表达最少，在脑梗死1 d组表达最多，见表1。

蛋白ApoA1ApoBBDNF对照组9.30±1.491.40±0.841.10±0.74脑梗死1d组5.60±1.581)4.90±1.201)9.70±1.641)脑梗死3d组4.50±1.311)6.38±1.851)2)8.13±1.891)脑梗死1w组3.29±1.601)7.14±1.861)2)6.43±1.991)2)脑梗死2w组1.86±0.901)2)9.71±1.601)2)3)1.14±0.693)4)

与对照组比较:1)P<0.05；与脑梗死1 d组比较:2)P<0.05；与脑梗死3 d组比较:3)P<0.05；为与脑梗死1 w组比较:4)P<0.05

图1　脑梗死大鼠脑组织的HE染色结果(×200)

3讨论

脑梗死是临床上常见且高发的脑血管疾病，因高复发率、高死亡率和高致残率严重影响患者预后生活并加重患者家庭负担。近年来的临床数据显示，脑梗死的发病率在我国有明显上升趋势，因此对脑梗死的深入有助于为临床疾病治疗新靶点、新方法提供新思路。血脂代谢异常而导致血脂水平紊乱是脑梗死发病的高危险因素，大量临床研究证实了动脉粥样硬化与脑梗死之间的密切联系〔9,10〕。血脂水平升高后，一方面会引起血管壁病变诱发炎症导致血小板凝集形成血栓阻塞脑血管造成大脑缺血性坏死，另一方面血脂黏稠会使血管狭窄诱发脑供血不足导致脑梗死。载脂蛋白是血浆蛋白的基本组成部分，对血脂正常代谢具有重要作用。ApoA1是HDL的重要结构蛋白，研究发现ApoA1有促进脂类运输、调节脂类代谢酶活性和促进胆固醇分解等重要生物活性，其对维持血脂代谢正常和降低动脉粥样硬化病变具有重要意义〔11〕；而ApoB是LDL的主要结构蛋白，它可以诱导胆固醇在巨噬细胞中发生内酯化反应，诱导巨噬细胞转变为泡沫细胞，加剧动脉硬化病变发展〔12〕。BDNF是一种重要的神经生长因子，具有促进血管和神经生成、促进感觉器官恢复和提高运动能力的生物作用〔13〕。研究发现BDNF可以减少神经元细胞氧化损伤，抑制细胞氨基酸兴奋中毒，促进神经干细胞的生长与分化〔14,15〕。本研究表明无干涉脑梗死后大脑损伤逐步加重且脑梗死面积逐渐增大。大鼠脑梗死后部分脑组织会因缺血坏死而丧失其功能，而且损伤大脑细胞会释放出大量谷氨酸盐，导致毗邻细胞氨基酸兴奋性中毒，大量的外Ca2+会内流进细胞诱导损伤细胞大量凋亡。大脑水肿和损伤会影响组织内脂质正常代谢，加剧脑梗死发展。本研究分析发现大鼠脑梗死后大脑组织ApoA1随着梗死时间呈下降趋势，ApoB随着梗死时间呈上升趋势，而BDNF在梗死后表达迅速升高然后随时间呈下降趋势。BDNF在脑梗死后迅速升高可能是大脑组织应急期的自我代偿机制，对大脑进行保护和修复，但是随着梗死时间延长大量神经细胞凋亡最终导致BDNF水平降低。

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〔2014-05-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

中图分类号〔〕R743〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6675-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.014