碱性纳米羟基磷灰石根充糊剂抑菌性的实验研究①

韩俊玲，王健平，张　艳，王佳琦

(佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002)



碱性纳米羟基磷灰石根充糊剂抑菌性的实验研究①

韩俊玲，王健平，张艳，王佳琦

(佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002)

摘要：目的：将不同碱性pH值纳米羟基磷灰石粉末，按比例经生理盐水调制成糊剂，体外研究这种根充糊剂对根管内常见致病菌(白色念珠菌，粪肠球菌)的抑制作用。方法：应用琼脂扩散法(ADT)针对白色念珠菌及粪肠球菌这两类根管常见致病菌，评价pH=10纳米羟基磷灰石糊剂，pH=11纳米羟基磷灰石糊剂，pH=12纳米羟基磷灰石糊剂对其的体外抑制作用，对照组采用的是VITAPEX根充糊剂及氢氧化钙糊剂。结果及结论：VITAPEX根充糊剂，氢氧化钙糊剂，pH=12纳米羟基磷灰石糊剂对白色念珠菌、粪肠球菌均有抑制作用。pH=10，pH=11纳米羟基磷灰石糊剂对白色念珠菌、粪肠球菌没有抑制作用。VITAPEX、pH=12纳米羟基磷灰石糊剂对白色念珠菌的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)，VITAPEX根充糊剂对粪肠球菌的抑制作用优于pH=12纳米羟基磷灰石糊剂(P<0.05)。氢氧化钙糊剂对白色念珠菌、粪肠球菌的抑制作用优于pH=12纳米羟基磷灰石糊剂(P<0.05)。pH=12纳米羟基磷灰石糊剂对粪肠球菌及白色念珠菌的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)。

关键词：纳米羟基磷灰石；白色念珠菌；粪肠球菌；抑菌性

龋病、牙髓病、根尖周病是口腔内科临床上最容易接触到的三大类疾病，由多种因素相互作用而成，其中细菌因素被认为是其主要致病因素。根管治疗术(RCT)是治疗这两类疾病最有效最彻底的方法，但人为的根管预备很难将根管系统的每一个角落都处理到，副侧管的存在为我们的治疗增加了难度，此时根管充填中的根充糊剂起到了很大的作用。目前临床上所应用的根充糊剂类其抑菌作用有限，很难达到长期的效果，因此我们还应寻找更为有效的根充糊剂。纳米羟基磷灰石是一种具有生物相容性、骨诱导性等特性的新型材料，其存在的生物特性使其作为一种新型材料应用于口腔临床多个学科。在制作纳米羟基磷灰石的过程中可根据需要调整其pH值，研究证实不同pH值可表现在n-HA纯度跟颗粒细度的不同，随着pH值的增大，其纯度也逐渐增大，颗粒则越来越小。对纳米羟基磷灰石作为根充糊剂的研究较多，但对其不同pH值的研究较少，故本实验将在此方面进行研究，以求寻找一种更好的。

1　材料及方法

1.1材料

粪肠球菌、白色念珠菌、不同pH值纳米羟基磷灰石、生理盐水、脑心浸液琼脂(BHI))、脑心浸出液肉汤(BHI)、沙氏培养基、无菌培养皿、氢氧化钙糊剂、VITAPEX根充糊剂等。

1.2仪器

恒温培养箱、净化工作台、电子天平、无菌打孔器、游标卡尺、接种环、无菌棉捻子、酒精灯等。

1.3试验方法及步骤

1.3.1实验分组

A.pH=10 纳米羟基磷灰石糊剂(pH=10 纳米羟基磷灰石与生理盐水调成糊剂)；B.pH=11 纳米羟基磷灰石糊剂( pH=11 纳米羟基磷灰石与生理盐水调成糊剂)；C.pH=12 纳米羟基磷灰石糊剂(pH=12 纳米羟基磷灰石与生理盐水调成糊剂)；D．vitapex根充糊剂；E．氢氧化钙糊剂。

1.3.2实验方法步骤

实验菌悬液的获取 将实验所用的粪肠球菌、白色念珠菌标准菌株经BHI液体培养基培养复苏后，接种于BHI固体培养基上，培养皿封好后放置在37℃恒温培养箱中培养24h，即取得第一代菌种。从培养皿上用无菌接种环调取24h纯培养物(最好为单个小菌落)并接种于BHI液体培养基，封好口后放置恒温振荡培养箱中振荡培养24h，矫正菌液浓度0.5McFarland(每毫升1×108个细菌)以备后续使用。根据琼脂扩散法的方法用无菌打孔器(直径6mm)打孔，在每个培养基的中间打一个孔，大小为6mm×6mm，并保证孔的底部有琼脂封底。用无菌棉捻子沾取矫正好的粪肠球菌菌液接种于打好孔的BHI琼脂培养基，白色念珠菌菌液接种于打好孔的沙氏培养基，在接种时应注意在培养基表面均匀涂抹，并且不要用力过大破坏培养基，最后将棉捻子绕平板外缘涂抹一周，将平板放置在室温环境中干燥并吸收菌液5min。

抑菌环直径的获取 将按比例新鲜调制的实验糊剂放入相应的孔内，注意放入糊剂时不可超出孔外，将培养基封好并放入37℃恒温培养箱内培养24h，在显微镜下用游标卡尺“十”测量并记录抑菌环的直径，每个标本重复多做几例，做好标记，经测量记录结果，用统计学软件进行方差分析。

2　结果

VITAPEX根充糊剂，氢氧化钙糊剂，pH=12纳米羟基磷灰石糊剂对白色念珠菌、粪肠球菌均有抑制作用。pH=10，pH=11纳米羟基磷灰石糊剂对白色念珠菌、粪肠球菌没有抑制作用。VITAPEX、pH=12纳米羟基磷灰石糊剂对白色念珠菌的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)，VITAPEX根充糊剂对粪肠球菌的抑制作用优于pH=12纳米羟基磷灰石糊剂(P<0.05)。氢氧化钙糊剂对白色念珠菌、粪肠球菌的抑制作用优于pH=12纳米羟基磷灰石糊剂(P<0.05)。pH=12纳米羟基磷灰石糊剂对粪肠球菌及白色念珠菌的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　实验所得数据

分 组白色念珠菌粪肠球菌pH=10n-HA糊剂6.00±0.006.00±0.00pH=11n-HA糊剂6.00±0.006.00±0.00pH=12n-HA糊剂10.83±1.2612.33±0.58VITAPEX根充糊剂12.33±0.7614.84±0.29氢氧化钙糊剂19.67±1.5224.83±0.76

(因抑菌环直径包括中间所打孔的直径，孔的直径为6㎜，pH=10，pH=11纳米羟基磷灰石糊剂对细菌没有抑制作用，所以只有中间孔的直径，为6㎜)

3　讨论

多项研究表明导致牙髓病根尖周病的主要原因是细菌感染[1],细菌能够导致牙髓感染主要是由于其在根管内以生物膜形式存在[2]，细菌与其所形成的生物膜在根管内形成根管微生态系统，不仅能够有效的抵抗来自宿主的免疫反应，还不能经根管治疗轻易去除。经器械进行根管预备、药物等进行根管消毒后，根管内残留细菌的进一步消除，这有赖于根管充填所用根充糊剂本身的作用，使其不仅应具有严密的根尖封闭性能、对根尖周组织无毒无刺激性，还能发挥缓慢而持续的消毒作用，以提高根管治疗的成功率[3]。

多数学者经研究证明导致根管继发性感染或持续性感染的主要致病菌为粪肠球菌及白色念珠菌[4]，白色念珠菌与粪肠球菌同时存在于根管的牙本质小管中，对多种根管消毒药物有抵抗作用，尤其是可长期饥饿生存的粪肠球菌。故本实验选取这两种菌作为实验菌进行实验研究。

氢氧化钙糊剂现如今作为一种临床上常用的根管消毒剂，能对细菌产生抑制作用主要是因其具有强碱性(pH=12.5~12.8)，能影响菌体细胞膜的带电荷性质和稳定性，还能促使细菌细胞膜上的蛋白发生变性，影响细胞膜的通透性而使其死亡；其次是因为OH-可以同细菌的DNA发生反应，诱导其双螺旋结构发生解螺旋，从而造成遗传信息的丢失，进而影响细菌的DNA复制。但氢氧化钙糊剂封闭性能稍差，容易吸收强度也不够，还容易造成根折，没有阻射性，根充后不能确切显示根充状态，所以现今很少作为根冲糊剂使用。

VITAPEX是一种新型的根管充填材料[5]，本实验应用的VITAPEX的成分为氢氧化钙，碘仿，羧甲基纤维素钠盐，基甲基硅烷和橄榄油。使这种材料不仅拥有氢氧化钙的功能，还具有碘仿的消毒防腐和杀菌作用。

研究发现，人体内经生物矿化的羟基磷灰石其结构显为纳米结构。经人工合成的纳米羟基磷灰石颗粒大小介于1~100之间，比一般生物体内的细胞都小，其成分和结构与天然骨又具有相似性，还具有优良的生物相容性、骨诱导性，同时还是一种生物可降解的材料[6，7]。Webster[8]等发现，纳米粒子可增加破骨细胞的活性，这表明纳米级纳米羟基磷灰石粒子的表面生物活性可能更有利于新骨的形成和改建。此外该材料所具的骨诱导性可使其超出根尖孔部分与根尖周组织接触，并通过一定过程修复根尖周骨质破坏。这将不仅有利于减轻材料本身对根尖周组织化学刺激，有利于根尖周炎症的恢复，更有可能形成骨质从而促进根尖孔的封闭，因此将其用于根管治疗有一定的生物学基础。经实验研究显示生成纳米羟基磷灰石晶体较好的溶液酸碱度应控制在10~12之间[9]，故本实验选取这三个pH值做试验研究。纳米羟基磷灰石本身并没有抑菌性，纳米羟基磷灰石糊剂有抑菌作用也不是依靠纳米羟基磷灰石，而是有赖于其添加物，如碘仿。但纳米羟基磷灰石所具有的纳米级拥有不同于大颗粒羟基磷灰石的独特特性，纳米级羟基磷灰石能通过大量吸附与细菌代谢相关的酶来干扰细菌的代谢[10]，这为n-HA在抑菌过程中起一定作用提供了理论基础。本实验采用的是纯的纳米羟基磷灰石，经生理盐水调制成糊剂，因此结果显示pH=10、pH=11的纳米羟基磷灰石并没有抑菌效果，而pH=12的纳米羟基磷灰石是靠其强碱性产生抑菌性，虽然结果显示其抑菌性不及氢氧化钙糊剂，也不及成品vitapex,但真正的根充糊剂由多种成分组成，将何种成分混入纳米羟基磷灰石糊剂中增加其抑菌效果，使其更有利于根管治疗的成功将需我们进一步实验研究。

参考文献：

[1]Siqueira JF Jr.Aetiology of root canal treatment failure why well-treated can fail[J].Int Endod J,2001,34(1):110

[2]郭惠杰，岳林，高岩，等.感染根管内细菌定值状态的观察[J].北京大学学报，2011,43(1):26-28

[3]Brook I, Frazier EH, Gher ME.Aerobic and anaerobic microbiology of periapical abscess[J].Oral micro Immuno，1991，6(2):123-125

[4]Gomes BP, Pinheiro ET, Sousa EL, et al. Enterococcus faecalis in dental root canals detected by culture and by polymerase chain reaction analysis[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006,102(2):247-253

[5]杨启祥，蒋晓蓉.常用临床根管充填材料的应用[J].同济大学学报，2003,124(1)：66-68

[6]孙庆治，李金良，李忻轩.纳米羟基磷灰石种植体的实验研究[J].黑龙江医药科学，2012,35(1)：52-53

[7]赵刚，尹蒙熔，李德超，等.纳米羟基磷灰石修复牙槽骨缺损后正畸牙齿移动的可行性研究[J].黑龙江医药科学，2010,33(3)：10-11

[8]Webster TJ，Ergun C,Dorem us RH,et al. Enhanced O steob last like cell function on nanophase ceram ics [J].Biam ateriais,2001,22(11):1327-1333

[9]王德平，王璐，黄文旵，等.pH值对化学沉淀法制备纳米羟基磷灰石的影响[J].同济大学学报，2005,33(1)：93-98

[10]Cox CF, Subay RK, Suzuki S, et al. Int J Periodontics Restorative[J].Dent,1996,16(3):240-251

中图分类号：R783.1

The bacteriostatic experimental study about the root canal filling
paste-Alkaline nano hydroxyapatite (n-HA)

HANJun-ling,WANGJian-ping,ZHANGYan,WANGJia-qi

(The Second Affiliated Hospitai of Jimusi University, Jiamusi 154002,China)

Abstract:Objective: This experiment aims to mix nano-hydroxyapatite powders with different alkaline pH and moderate amount of normal saline to form a paste and study the inhibition effect of root canal filling paste on common pathogenic bacteria in root canal (Candida albicans and Enterococcus faecalis). Methods: By using the agar diffusion method (ADT) for the root of Candida albicans and Enterococcus faecalis-tube common pathogenic bacteria, we can evaluate the inhibition effect on nano hydroxyapatite past of 10 pH,11 pH and 12 pH, while the comparative group were used Vitapex root canal filling paste and calcium hydroxide paste. Results and conclusion: Vitapex root canal filling paste, calcium hydroxide paste, nano hydroxyapatite paste of 12 pH all have inhibition effects on Candida albicans, Enterococcus faecalis. Nano hydroxyapatite paste of 10 and 11 pH have no inhibition effect. Vitapex and nano hydroxyapatite paste of 12 pH's inhibition effects on Candida albicans don't have statistical significance (P>0.05). The inhibition effect of Vitapex root canal filling paste on Enterococcus faecalis was better than that of nano hydroxyapatite paste of 12 pH (P<0.05).The inhibiting effect of Calcium hydroxide paste paste on Candida albicans、Enterococcus faecalis are better than nano hydroxyapatite paste of 12 pH(P<0.05). Nano hydroxyapatite paste of 12 PH's inhibition effects on Enterococcus faecalis and Candida albicans don't have statistical significance (P>0.05).

Key words:nano-hydroxyapatite;Candida albicans;Enterococcus faecalis;antibacterial activity

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-0041-02

基金项目：①佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2015-063。

作者简介：韩俊玲(1989~)女，山东淄博人，在读硕士研究生。

通讯作者：王健平(1959~)男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授。E-mail：yaner_15246483385@163.com。

(收稿日期：2015-09-09)