多烯磷脂酰胆碱对树突状细胞的抑制作用研究

潘伟 郝文婷 李向阳 徐慧雯 孙芬芬

·实验研究·

多烯磷脂酰胆碱对树突状细胞的抑制作用研究

潘伟 郝文婷 李向阳 徐慧雯 孙芬芬

目的研究多烯磷脂酰胆碱(PPC)对树突状细胞(DC)表型分化及分泌炎症因子的影响,探讨PPC抗炎作用。方法8只SPF纹雌性Balb/c小鼠,随机分为四组,每组2只。运用免疫磁珠分析小鼠脾脏DC,分别加入PPC(PPC组,2只)、脂多糖(LPS,LPS组,2只)、PPC+LPS(PPC+LPS组,2只)以及磷酸盐缓冲液(PBS,PBS组,2只)进行刺激。24 h后收集细胞及培养上清,流式细胞术检测DC表面活化分子表达情况,流式微珠阵列法(CBA)检测细胞因子分泌情况。结果PPC组DC表面CD40、CD80、CD86、主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ分别为(23.43±2.79)%、(19.41±1.33)%、(44.30±3.16)%、(80.87±1.32)%,低于PBS组的(29.10±8.14)%、(31.81±1.02)%、(47.70±6.32)%、(83.17±2.84)%；且显著低于LPS组的(42.33±0.58)%、(63.57±2.61)%、(56.07±0.06)%、(86.20±0.95)%(P<0.01)；PPC+LPS组CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分别为(16.73±3.14)%、(16.12±1.92)%、(43.60±0.95)%、(78.83±1.46)%,显著低于LPS组(P<0.01)。PPC组和PPC+LPS组白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)显著低于LPS组(P<0.01)。PPC+LPS组单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平明显低于LPS组(P<0.01)。结论PPC可通过抑制DC活化及炎症因子释放,发挥抗炎效果。

多烯磷脂酰胆碱；树突状细胞；细胞表型；炎症因子

磷脂酰胆碱(PC)又称为卵磷脂,由磷脂酰基与胆碱的羟基酯化形成,具有护肝［1,2］、健脑、美容等功效。近年来发现其对机体炎症反应的调节作用已在肠炎、类风湿性关节炎［1］模型中证实,PC可以抑制TNF-α、IL-6等促炎因子释放,促进IL-10等抗炎因子分泌,从而缓解病情。DC是目前已知的最有效的专职抗原提呈细胞,贯穿于炎症反应发生发展过程中。成熟的DC表达高水平MHC-Ⅱ以及协同刺激分子,可分泌多种细胞因子,调节Th细胞分化；也可将抗原递呈给T细胞并使之活化,启动机体的初次免疫应答。那么PC是否通过抑制DC成熟以及炎症因子释放,下调机体炎症反应,目前尚不清楚。本文以PC衍生物——PPC为研究对象,明确其对DC的体外抑制作用,为阐明PC的抗炎机制提供见解。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 实验动物 6～8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠8只,体重18～22 g,购自上海斯莱克实验动物责任有限公司。8只小鼠随机分为四组,每组2只。

1.1.2 实验试剂 青霉素、链霉素为美国GIBCO公司产品；PPC注射液购自赛诺菲安万特(北京)制药有限公司；Mouse inflammation kit及 Cytometric bead array mouse/rat soluble protein master buffer kit,为美国BD公司产品；抗小鼠 FITC-CD11c、PerCP-Cy5.5-CD80、PE-Cy7-CD86、PECD40、APC-MHC-Ⅱ及其同型对照,流式染色缓冲液,为美国eBioscience公司产品；Mouse CD11c microbeads,为德国Miltenyi公司产品。

1.1.3 主要仪器 离心机购自德国Eppendorf公司及美国Beckman公司；FACSCanto Ⅱ流式仪及FCAP 3.0软件购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DC分离及刺激 剖杀Balb/c小鼠,无菌取脾脏,制备单细胞悬液,采用CD11c分离试剂盒阳性分选DC细胞,流式细胞仪鉴定其纯度为90%以上。以1×106cells/ml的浓度铺于24孔板,分别加入1 μg/ml LPS(LPS组,2只),20 μg/ml PPC(PPC组,2只),1 μg/ml LPS+20 μg/ml PPC(PPC+LPS组,2只),同时设等体积PBS为阴性对照的PBS组(2只)。每组设3个重复孔。置于5% CO2培养箱中培养24 h后,收集上清及细胞沉淀,备用。

1.2.2 DC表型测定 用PBS重悬细胞沉淀,加入流式管,每管200 μl,混匀后,分别加入CD11c-FITC/CD40-PE/CD80-PerCP-Cy5.5/CD86-PE-Cy7/MHC-Ⅱ-APC抗体,同时设置空白对照及单标管。避光室温反应30 min后,用流式染色缓冲液洗涤1次,每管各加入100 μl流式染色缓冲液重悬细胞,用FACSCanto Ⅱ流式仪进行上机检测,FlowJo 7.6.1软件分析数据。

1.2.3 细胞因子检测 采用小鼠炎症因子检测试剂盒检测细胞培养上清中IL-6、TNF、MCP-1、IL-12p70、IL-10的水平。具体标记方法参照说明书。将标记好的样本用流式细胞仪进行检测,利用FCAP 3.0软件进行细胞因子浓度的换算。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PPC对DC表型分化的影响 PPC组DC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分别为(23.43±2.79)%、(19.41±1.33)%、(44.30±3.16)%、(80.87±1.32)%,低于PBS组的(29.10±8.14)%、(31.81±1.02)%、(47.70±6.32)%、(83.17±2.84)%；且显著低于LPS组的(42.33±0.58)%、(63.57±2.61)%、(56.07±0.06)%、(86.20±0.95)%(P<0.01)。PPC+LPS组 CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分别为(16.73±3.14)%、(16.12±1.92)%、(43.60±0.95)%、(78.83±1.46)%,显著低于LPS组(P<0.01)。

2.2 PPC对DC分泌炎症因子的影响 PPC组培养上清中IL-6、TNF的含量分别为(4.27±0.57)、(123.18±8.82)pg/ml,与PBS组的(9.44±4.06)、(139.35±45.87)pg/ml比较差异无统计学意义(P>0.05)；但显著低于LPS组的(48.23±7.85)、(471.40±61.07)pg/ml(P<0.01)。PPC+LPS组IL-6、TNF水 平分别为(4.32±0.93)、(121.47±13.37)pg/ml,显著低于LPS组(P<0.01)。PBS组、PPC组和LPS组的MCP-1水平分别为(18.13±1.38)、(22.51±10.47)、(19.86±2.15)pg/ml,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。而PPC+LPS组的MCP-1水平为(11.43±1.51)pg/ml,明显低于LPS组(P<0.01)。

3 讨论

本研究利用体外模型探讨了PPC对DC的抑制作用,发现PPC可下调DC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子的表达,抑制IL-6、TNF等炎症因子分泌,并能抑制LPS诱导的DC活化及炎症反应,提示PPC可通过作用于DC发挥抗炎效应。

PPC是一种临床疗效较为肯定的护肝药［1］,含有PC和大量不饱和脂肪酸。其化学结构与内源性磷脂一致,可直接影响膜结构,使受损肝功和酶活恢复正常；也可调节肝脏能量平衡,将中性脂肪和胆固醇转化成容易代谢的形式,从而发挥护肝作用。本研究发现PPC可通过作用于DC诱导抗炎作用,可为进一步开发PPC作为抗炎药物奠定基础。

［1］胡国平,刘凯,王甦,等.多烯磷脂酰胆碱(易善复)治疗慢性肝炎的系统评价.中国循证医学杂志,2005,5(7):543-548.

［2］张民杰,杨敏,张宗权.易善复治疗黄褐斑疗效分析与评价.临床合理用药杂志,2011,4(5C):51-52.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.24.125

2016-10-25］

江苏省教育厅高校自然科学研究基金面上项目(项目编号：15KJB310025)；江苏省博士后科研资助计划(项目编号：1501061A)；徐州医学院优秀人才启动基金(项目编号：D2015004)

221004 徐州医科大学病原生物学与免疫学教研室、感染与免疫实验室(潘伟 郝文婷 李向阳徐慧雯)；形态学实验教学中心(孙芬芬)

孙芬芬