超高效液相法测定卡马西平和苯妥英钠血药浓度及其临床应用

何文姬　孙帮燕　张　桢*．昆明市儿童医院心脏功能科，云南　昆明　65008．昆明医科大学附属儿童医院/昆明市儿童医院中心实验室，云南　昆明　65008

超高效液相法测定卡马西平和苯妥英钠血药浓度及其临床应用

何文姬1孙帮燕2张桢2*
1．昆明市儿童医院心脏功能科，云南昆明650028
2．昆明医科大学附属儿童医院/昆明市儿童医院中心实验室，云南昆明650028

【摘要】目的:在儿科临床上建立一种快速、准确测定癫痫患儿血浆中卡马西平(Carbamazepine，CBZ)和苯妥英钠(Phenytoin，PT)浓度超高液相(Ultra performance liquid chromatography，UPLC)方法，并观察药物浓度与不良反应。方法:收集癫痫患儿的超声肝脏检查和实验室检查资料。UPLC方法:取患儿血浆200μl，加入乙酸乙酯1.0 ml，涡旋1 min，室温高速离心7 min(12 000×g)，取上清液700 μl吹干后，100 μl甲醇复溶进样分析;色谱条件为BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm; Waters公司)，0.3 ml·min－1的流速，甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55，v/v)，30℃的柱温，2 μl的进样量，254 nm检测波长。结果:血浆中CBZ和PT色谱峰分离良好，无干扰，曲线为y =39589x +15280，R2=0.9991(CBZ); y =3739.5x +3073.5，R2= 0.9996(PT)，回收率均在90%～117%;超声检查和实验室检查显示正常，无造血及消化系统不良反应。结论:本法操作简便，适用于临床工作中，患儿血浆的CBZ、PT浓度快速监测。

【关键词】卡马西平;苯妥英钠; UPLC;血药浓度

通读作者:张桢

癫痫是中国神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症，也是一种由多种原因引起的慢性、反复发作神经系统常见疾病，药物控制仍是当前主要的治疗手段[1]。CBZ是一种优秀的抗癫痫药物; PT是治疗癫痫大发作和局限性发作的首选药物。但由于二者具有自身诱导作用，体内处置过程复杂，治疗剂量范围窄(CBZ和PT有效浓度范围分别为4～12和10～20μg/mL)，疗效及毒性与血药浓度关系密切，且患者间个体差异很大，长期服用不良反应较多，易产生耐药性，因此对其体内血药浓度进行监测十分必要[2]。监测方法有高效液相法、荧光偏免疫法及酶增强免疫法。免疫法操作简单，但试剂价格昂贵，专一性差。HPLC准确、专属性强、重现性好，可同时测定多种药物及其代谢产物[3]。本文建立了UPLC法测定CBZ和PT血药浓度方法，并调查统计其在儿科临床应用情况，观察药物对儿童是否产生不良反应。

1　UPLC法测定药物浓度含量方法建立

1.1仪器、试剂和色谱条件

1.1.1仪器、试剂Waters－ACQUITY－UPLC超高效液相色谱仪(Waters，美国); Empower数据处理系统; Sartorius BT125D电子天平(德国赛多利斯仪器系统有限公司); MULTIFUGE X1R超高速离心机(Thermo公司，美国); XW－80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂); CBZ对照品(美国sigma公司，批号: 344360050); PT(中国药品生物制品检定所，批号: 100138－200603);甲醇:色谱纯(美国Fisher公司);水:自制超纯水(水机，英国PURELAB ELGA公司)。

1.1.2色谱条件色谱柱为BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm; Waters公司);流速为0.3 ml·min－1;流动相为甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55，v/v);柱温为30℃;进样量: 2 μl;检测波长为254 nm。

1.2样品测定

1.2.1储备液的配制取CBZ对照品2.5 mg和PT5.0 mg，精密称定，置5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得浓度为500(CBZ)和1000(PT)mg·L－1的储备液。

1.2.2血样预处理取血浆200μl，加入乙酸乙酯1.0 ml，涡旋1 min，高速离心7 min(12000×g)，取上清液700 μl，吹干后，100 μl甲醇复溶，2μl进样分析。

1.3线性关系和线性范围取空白血浆160 μl共10份，分别加入40 μl不同浓度CBZ和PT，配成浓度为0.5、2.5、5、10、20、40μg/ml和1、5、10、20、40、80μg/mL溶液，按“3.2血样预处理”操作，以浓度与峰面积作线性回归，得标准曲线方程(CBZ为y = 39589x + 15280，R2= 0.9991; PT为y =3739.5x +3073.5，R2=0.9996)。CBZ在0.5～40μg/ml浓度线性关系良好，PT在1～40μg/ml线性关系良好。CBZ和PT最低检出限分别为0.1、0.21μg/ml。

1.4方法专属性CBZ和PT色谱峰不受血浆中内源性物质的干扰，见图1－2。

图2　标准品经“3.2”处理后浓度为8μg/ml CBZ(保留时间为3.940min)和6μg/ml PT(保留时间为3.328min)色谱图。

1.5回收率实验标本加入0.5～2倍标准品后，按3.2处理，计算回收率，结果见表1。实验室数据与正常儿童参考值比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，详见表2。

表1　方法回收率统计表

表2　实验室数据与正常儿童参考值比较(±s)

表2　实验室数据与正常儿童参考值比较(±s)

CBZ正常组　CBZ小于有效浓度下限组CBZ大于有效上限组　PT正常组　PT小于有效浓度下限组PT大于有效上限组正常儿童参考值总胆红素(μmol/mL)　10.7±2.5　11.0±2.0　12.2±1.5　10.1±2.1　11.0±2.3　12.2±1.5　3.4～17.7直接胆红素(μmol/mL)　2.0±0.5　1.7±0.4　1.5±0.27　2.1±0.4　1.9±0.45　1.6±0.3　0～3.4血小板(109/L)　217±70　202±60　230±50　217±71　202±62　230±55　100～300白细胞数(109/L)　7.0±1.5　6.2±1.7　6.2±1.7　5.3±0.9　6.5±1.7　6.7±2.3　4～10

1.6稳定性实验

1.6.1储备液稳定性考察储备液4℃冷藏保存，分别在1、3、5、7、60d后，配制标准使用液4、50μg/ml直接进样测定，峰面积RSD低于7%，表明储备液至少在60d稳定。

1.6.2血样稳定性考察分别配制高中低浓度的标本，－20℃冷冻保存，分别在0、12、24、36h测定，峰面积RSD均低于10%。

2　临床应用与结果统计

2.1标本收集收集昆明医科大学附属儿童医院(昆明市儿童医院)2011.4～2013.4癫痫患儿1667例癫痫患儿，有150例服用CBZ(包括与丙戊酸联合用药31例)，PT为37例。患儿血药浓度达稳态浓度后，采集样本，按3.2测定。

2.2统计学方法采用SPSS12.0软件对数据进行处理。收集白细胞数、血小板、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、和胆红素[2]数据，部分结果以(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.3结果血浆中药物浓度: CBZ在1～17.0μg/ml，PT 在3～24.0μg/ml;各组实验室指标中谷丙转氨酶和谷草转氨酶值均在正常范围，其它各项实验室指标与正常儿童参考值P均大于0.05(表1);超声波检查，患儿肝脏形态大小正常，包膜完整，肝实质回声均匀，肝血管清晰可见，其内未见异常回声;患儿也未出现血液系统及消化系统不良反应。

3　讨论

3.1UPLC方法色谱条件参考抗癫痫药物HPLC[2－5]的色谱条件，都不能得到满意的UPLC色谱图，减小流动相的极性(减少甲醇比例)，二者分离度增加，但PT的色谱峰拖尾，在流动相水中加入酸后，色谱峰有所改善，最终确定流动相为甲醇－1%三氟乙酸水溶液(45∶55)。在本文中，UPLC色谱条件与文献报道的HPLC色谱条件不大一致可能的原因是二者C18色谱柱填料颗粒粒径大小不同。

3.2单个样本采集量因儿童采血较成人困难，最终确定单个样本量(血浆)为200 μl，可以获得理想色谱峰，且采血量易被家长接受，可长期配合医生开展治疗药物浓度监测。

3.3癫痫药物临床应用统计收集1667例癫痫患儿样本中，只有150例服用CBZ(包括与丙戊酸联合用药31例)，PT为37例。可能与下面因素有关:①与治疗药物有效血药度范围宽窄和药物副作用有关，如CBZ和PT比丙戊酸范围要窄得多，故大部分医生和家长选择丙戊酸，以便于更好控制患儿服药剂量;②类似药物心理效应[6]，“家长药物心理效应”影响癫痫患儿长期用药的种类，如在家长配合医生治疗孩子癫痫疾病时，给孩子用药易受到外界暗示(受到医生、网络、广告和书籍等)，相对于CBZ和PT，家长对丙戊酸治疗癫痫更有药物认同感和更愿意选择丙戊酸治疗孩子疾病。

3.4实验室检查和超声检查均未见报道不良反应[2]，可能与样本量小有关。

参考文献

[1]欧阳华，刘弋戈．抗癫痫药物不良反应分析[J]．儿科药学杂志，2005，11: 57－59．

[2]印晓星．治疗药物监测[M]．北京:人民军医出版社，2011: 170 －201．

[3]程振田，郭瑞臣，王本杰，等．HPLC测定人血清苯巴比妥卡马西平、苯妥英钠浓度及其与FPIA法测定结果的比较[J]．中国药学杂志，2008，43(12): 950－954．

[4]樊鹏程，马骏，贾正平，等．在线柱切换RP－HPLC测定人血清中卡马西平浓度[J]．药物分析杂志，2008，28(12): 2033－2035．

[5]Steins LSW，Bouw J，Weide J．Evaluation of fluorescence polarization assays for measuring valproic acid，phenytoin，carbamazepine and Phenobarbital in serum [J]．The Drug Moit，2002，24(3): 432－435．

[6]赵兰民，杨春．药物的心理效应与临床应用[J]．临床身心疾病杂志，2007，13(1): 69－70．

收稿日期:( 2014.11.12)

基金项目:云南省高层次卫生技术人才培养(计划编号: D－201254)。

【文章编号】1007－8517(2015)03－0025－03

【文献标志码】A

【中图分类号】R748