豆豉姜中生物碱的pH区带逆流色谱分离研究

孙丽，宫成玉，杨鹏，陈燕平，杨丙田，刘建华

(1.山东省淄博市中医医院，山东 淄博 2553003；2.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000；3.济南三峰生物工程有限责任公司，山东 济南 250014；4.山东省分析测试中心，山东 济南 250014)



豆豉姜中生物碱的pH区带逆流色谱分离研究

孙丽1，宫成玉2，杨鹏3，陈燕平2，杨丙田3，刘建华4*

(1.山东省淄博市中医医院，山东 淄博 2553003；2.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000；3.济南三峰生物工程有限责任公司，山东 济南 250014；4.山东省分析测试中心，山东 济南 250014)

摘要：建立pH区带逆流色谱分离制备豆豉姜中生物碱的方法。运用pH区带逆流色谱对豆豉姜中的生物碱进行分离，以氯仿-甲醇-水(4:3:2，V/V)作为溶剂系统，在上相溶液中加入70 mmol/L盐酸作为固定相，在下相溶液中加入10 mmol/L三乙胺作为流动相，仪器转速为800 r/min，流速为2 mL/min，检测波长为254 nm，固定相保留率为65%。经一次pH区带逆流色谱分离，从1.5 g豆豉姜粗提物中得到波尔定 246 mg，六驳碱 524 mg和异波尔定 317 mg。经HPLC分析，其纯度分别为97.35%，95.48%，97.54%。研究结果表明，pH区带逆流色谱能对豆豉姜中的主要活性成分(阿朴啡型生物碱)进行有效的分离制备。

关键词：pH区带逆流色谱；豆豉姜；生物碱类化合物

豆豉姜为樟科木姜子属植物山鸡椒(Litseacubeba(Lour．) Pers.) 的根及根茎，该药性温、味辛苦，具有祛风散寒和理气止痛之功效，主要用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、感冒、心胃冷痛以及腹痛吐泻等症[1]。民间常用于治疗胃及十二指肠溃疡、中暑腹痛、劳倦乏力以及产后瘀血腹痛等各种临床病症。豆豉姜作为珍珠胃安丸、云香祛风止痛酊和正骨水等成方制剂的组成药物[2]，主要含有生物碱、木脂素和挥发油，其中阿朴啡型生物碱被认为是代表性活性成分[1]。现代药理研究表明，豆豉姜在抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、平喘、抗过敏和杀虫等方面都有较好的效果。Lin等[3]的研究表明豆豉姜粗提物对弗氏完全佐剂诱导的关节炎大鼠具有良好的治疗效果。然而，豆豉姜的主要药效物质仍不明确，且良好的传统用药效果和临床应用也亟需建立相应的质量评价方法。因此，对豆豉姜的化学成分进行研究是十分必要的。

pH区带逆流色谱是由高速逆流色谱发展而来的用于有机酸和生物碱制备级分离的色谱技术，分离原理是化合物的pKa值和极性的差异[4-5]。除了常规逆流色谱的优点外，pH区带逆流色谱具有进样量大，组分被高度聚集浓缩，特别是对于没有紫外吸收的样品也可以通过pH连续检测器进行检测等优点[6-7]。该技术已被广泛应用于可解离化合物的分离，包括生物碱、有机酸、合成染料[8-10]以及多肽衍生物[11]等。

本研究运用pH区带逆流色谱对豆豉姜中的阿朴啡型生物碱进行了制备级分离，得到3个高纯度化学成分波尔定、六驳碱和异波尔定(结构式见图1)。

图1　豆豉姜中生物碱类化合物的化学结构式Fig.1　Chemical structure of alkaloids from Litsea cubeba

1实验与方法

1.1试剂、仪器和材料

高效液相色谱用甲醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司)，水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。pH区带逆流色谱溶剂系统用氯仿、甲醇、盐酸和三乙胺等均为分析纯级(国药集团化学试剂有限公司)，水为去离子水。

TBE-300B高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)，该分离系统包括多层聚四氟乙烯螺旋管(直径2.6 mm，分离体积300 mL)、TBP5002泵、8823B紫外检测器(北京宾达英创科技有限司)和3057-11记录仪(重庆川仪总厂有限公司)。Waters 600-996高效液相色谱系统(配有光电二极管阵列检测器，美国沃特世公司)。

豆豉姜药材购于福建药材市场，经山东中医药大学李佳教授鉴定为樟科木姜子属植物山鸡椒的正品药材。

1.2生物碱粗提物的制备

6.5 kg豆豉姜药材，粉碎后用95%乙醇按体积比1：8混合，加热回流提取3次，每次提取2 h。过滤并合并提取液，减压回收乙醇得到总提取物。将总提取物用约1 000 mL 0.2%盐酸水溶液复溶，分别用等体积的石油醚和氯仿萃取3次，除去脂溶性杂质。再用氨水调节水层pH值至10，用等体积的氯仿萃取3次，合并氯仿层，减压回收氯仿得生物碱粗提物约6.5 g，用于pH区带逆流色谱分离，粗提物的HPLC分析结果如图2a所示。

1.3pH区带逆流色谱溶剂系统和样品溶液的制备

pH区带逆流色谱的溶剂系统为氯仿-甲醇-水(4:3:2,V/V)，总体积为2 L，按比例将各溶剂置于分液漏斗中震荡后，充分静置使其分层。使用时分取上下相，在上相溶液中加入70 mmol/L盐酸作为固定相，在下相溶液中加入10 mmol/L 三乙胺作为流动相，超声10 min，除去气泡待用。

取1.5 g豆豉姜生物碱粗提物，加入上下相溶液各10 mL超声溶解样品，其中上相溶液加入了70 mmol/L 盐酸，下相溶液未加入三乙胺，溶解后的溶液作为样品溶液进行pH区带逆流色谱分离。

1.4分离、分析与鉴定

1.4.1pH区带逆流色谱分离

上相 (固定相)溶液以15 mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪，待出口有固定相流出(约50 mL)时，将上述样品溶液从定量圈注入到高速逆流色谱仪中，然后启动仪器，将转速设定为800 r/min，待转速达到并稳定后，以2 mL/min的流速泵入下相 (流动相)溶液，同时开启检测器和记录仪，检测器的检测波长设定为254 nm，手动收集馏分，平均每3 min的流出液收集到一个试管中，直到分离结束，用压缩空气吹出螺旋管中剩余的液体，并计算出固定相的保留率。

1.4.2HPLC分析与化合物结构鉴定

豆豉姜生物碱粗提物以及经pH区带逆流色谱分离得到的组分均经HPLC进行分析。色谱柱型号为RIGOL-Compass C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；检测波长设定为310 nm；流动相为甲醇(A)-0.2%氨水(B)梯度洗脱：0～20 min, 40%～70% (A); 20～21 min, 70%～100% (A); 21～30 min, 100% (A)；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。pH区带逆流色谱所分得各化合物的化学结构由1H-NMR，13C-NMR和ESI-MS所提供的数据进行鉴定。

2结果和讨论

2.1HPLC条件优化

本研究探讨了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%氨水和乙腈-水(0.2%三乙胺)等作流动相时，豆豉姜生物碱粗提物中各成分的分离效果。经测试发现，当采用甲醇-0.2%氨水梯度洗脱：0～20 min, 40%～70% (A); 20～21 min, 70%～100% (A); 21～30 min, 100% (A)；流速设定为1.0 mL/min时，各成分能够实现基线分离，分析结果如图2a所示。

图2　豆豉姜粗提物和分离得到生物碱纯组分的HPLC分析图Fig.2　HPLC chromatograms of crude extract and separated alkaloids from Litsea cubeba

2.2pH区带逆流色谱溶剂系统优化

pH区带逆流色谱溶剂系统的选择不仅要求能够提供合适的KD值，而且要求对样品有较好的溶解性[5]。根据豆豉姜化学成分的理化性质，本研究选择氯仿-甲醇-水作为溶剂系统。我们考察了如下几个溶剂系统：氯仿-甲醇-水(4:2:2,V/V)上相溶液加入10 mmol/L盐酸，下相溶液加入10 mmol/L 三乙胺；氯仿-甲醇-水(4:3:2,V/V)上相溶液加入10 mmol/L 盐酸，下相溶液加入10 mmol/L三乙胺；氯仿-甲醇-水(4:3:3,V/V)上相溶液加入10 mmol/L 盐酸，下相溶液加入10 mmol/L三乙胺。经测试发现，溶剂系统氯仿-甲醇-水(4:3:2,V/V)上相溶液加入10 mmol/L 盐酸，下相溶液加入10 mmol/L 三乙胺能够提供较为合适的KD值。但在具体实验过程中，该溶剂系统并没有给出较好的分离效果，而是在较短的时间内将所有成分洗脱出来，这说明各成分的保留值太小，没有较好的分离度，所以要增大各成分的保留值。有文献报道[12]，增加上相溶液中保留酸的浓度可以增大各成分的保留值，从而可以避免各成分在较短的时间内被洗脱出来的现象。因此，我们将上相溶液中盐酸的浓度增加到30 mmol/L，测试后发现分离效果有一定的改善，但仍然不理想。我们继续增加保留酸的浓度，当盐酸浓度增加到70 mmol/L时，各成分实现了完全分离。从1.5 g豆豉姜粗提物中，经一次pH区带逆流色谱分离，得到波尔定 (I) 246 mg，六驳碱 (II) 524 mg和异波尔定 (III)317 mg，分离效果如图3所示。

图3　豆豉姜粗提物的pH区带逆流色谱图Fig.3　pH-zone-refining CCC chromatogram of crude extract 　from Litsea cubeba

2.3化合物的纯度检测

利用2.1中优化好的液相色谱条件对分得的各组分(波尔定，六驳碱和异波尔定)进行检测，纯度分别为97.35%, 95.48%和97.54%，分析结果如图2b～d所示。

2.4化合物的结构鉴定

化合物I (图2a中的峰I): ESI-MS,m/z328 [M+H]+;1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm: 7.85 (1H, s, H-11), 6.76 (1H, s, H-8), 6.57 (1H, s, H-3), 3.74 (3H, s, 10-OCH3), 3.52 (3H, s, 1-OCH3), 3.22 (1H, m, He-7), 3.03 (1H, m, He-5), 3.02 (1H, m, He-4), 2.71 (1H, m, H-6a), 2.63 (1H, m, Ha-5), 2.61 (3H, s,N-CH3), 2.53 (2H, m, Ha-4,Ha-7);13C NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ ppm:143.47 (C-1), 126.85 (C-1a), 126.85 (C-1b), 150.36 (C-2), 114.63 (C-3), 127.88 (C-3a), 27.17 (C-4), 52.12 (C-5), 62.04 (C-6a), 32.46 (C-7), 128.63 (C-7a), 115.83 (C-8), 146.55 (C-9), 146.79 (C-10), 112.47 (C-11), 122.94 (C-11a), 42.36 (N-CH3), 59.71 (1-OCH3), 56.13 (10-OCH3)。以上数值与文献[13]报道的基本一致，化合物I被确定为波尔定。

化合物II (图2a中的峰II): ESI-MS,m/z328 [M+H]+;1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ ppm: 7.88 (1H, s, H-11), 6.74 (1H, s, H-8), 6.74 (1H,s, H-3), 3.81 (3H, s, 10-OCH3), 3.77 (3H, s, 2-OCH3), 3.75 (1H, m, H-6a), 3.63 (3H, s, 1-OCH3), 3.27 (1H, d,J=4.0 Hz,He-5),2.91 (2H, m, Ha-5,He-4), 2.67(2H, m, Ha-4,He-7), 2.55 (1H, m, Ha-7);13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm:144.18 (C-1), 126.80 (C-1a), 126.46 (C-1b), 152.33 (C-2), 111.58 (C-3), 129.09 (C-3a), 28.25 (C-4), 42.14 (C-5), 53.30 (C-6a), 35.43 (C-7), 129.49 (C-7a), 115.55 (C-8), 146.54 (C-9), 146.64 (C-10), 112.85 (C-11), 122.93 (C-11a), 59.93 (1-OCH3), 56.17 (2-OCH3), 56.13 (10-OCH3)。以上数值与文献[14]报道的基本一致，化合物II被确定为六驳碱。

化合物III(图2a中的峰III) : ESI-MS,m/z328 [M+H]+;1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm:7.95 (1H, s, H-11), 6.72 (1H, s, H-8), 6.60 (1H, s, H-3), 3.75 (3H, s, 2-OCH3), 3.75 (3H, s, 10-OCH3), 2.94 (4H, m, He-7, He-4, He-5, H-6a), 2.57 (1H, m, Ha-4), 2.43 (3H, s,N-CH3), 2.32 (2H, m, Ha-5, Ha-7);13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm:141.42 (C-1), 120.43 (C-1a), 123.43 (C-1b), 147.25 (C-2), 109.85 (C-3), 126.74 (C-3a), 28.69 (C-4), 53.36 (C-5), 62.83 (C-6a), 33.94 (C-7), 129.49 (C-7a), 115.56 (C-8), 145.88 (C-9), 146.01 (C-10), 114.25 (C-11), 124.07 (C-11a), 43.85 (N-CH3), 56.38 (2-OCH3), 56.51 (10-OCH3)。以上数值与文献[15]报道的基本一致，化合物III被确定为异波尔定。

3结语

本文报道了应用pH区带逆流色谱技术从豆豉姜中分离出阿朴啡型生物碱波尔定、六驳碱和异波尔定。此类化合物的极性较小，从而导致各成分的保留值较低，本研究通过增加固定相中保留酸的浓度的方法来增加各成分的保留值，从而实现了pH区带逆流色谱对豆豉姜中主要化学成分的有效分离。本研究建立了一种豆豉姜化学成分快速、高效制备分离的方法，为建立豆豉姜的科学质量评价方法和阐明药效物质提供了物质基础和科学的依据。

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【中药与天然活性产物】

Separation and purification of alkaloids fromLitseacubeba(Lour．)Pers.

by pH-zone-refining counter-current chromatography

SUN Li1,GONG Cheng-yu2,YANG Peng3, CHEN Yan-ping2,YANG Bing-tian3,LIU Jian-hua4*

(1.Zibo Municipal Traditional Chinese Medicine Hospital, Zibo 255300, China;2.Yantai Entry-exit Inspection

and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China;3.Sanfeng Biological Engineering Technology Co.Ltd.,

Jinan 250014, China;4.Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014，China)

Abstract∶We construct a method for separating and purifying alkaloids from Litsea cubeba(Lour．) Pers.by pH-zone-refining counter-current chromatography (CCC).Our experimental conditions are solvent of chloroform-methanol-water(4:3:2,V/V),upper stationary phase of 70 mmol/L HCl, lower mobile phase of 10 mmol/L TEA, revolution speed of 800 r/min, flow rate of 2 mL/min, detection wavelength of 254 nm, and stationary phase retention rate of 65%.We acquire 246 mg of boldine, 524 mg of laurotetanine and 317 mg of isoboldine from 1.5 g crude extract of Litsea cubeba(Lour．) Pers.through one time pH-zone-refining CCC.Their purities are 97.35%, 95.48% and 97.54% by HPLC analysis.Results show that pH-zone-refining CCC can effectively separate and prepare major active components of Litsea cubeba(Lour．) Pers.,aporphine alkaloids.

Key words∶pH-zone-refining counter-current chromatography; Litsea cubeba(Lour．) Pers.; alkaloids

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2015)04-0041-05

通讯作者*，刘建华，男，研究方向为精密分析。Email: liujh@sdas.org

作者简介：孙丽(1964-)，女，研究方向为药事管理和中医药预防保健。

收稿日期：2015-07-01

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.008