核磁共振内标法测定乙基麦芽酚对照品的含量

王召平，朱姮，王晓，耿岩玲，仙云霞，于金倩*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省科学院中药过程控制研究中心，山东省分析测试中心，山东 济南 250014)



核磁共振内标法测定乙基麦芽酚对照品的含量

王召平1，朱姮1，王晓2，耿岩玲2，仙云霞1，于金倩2*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省科学院中药过程控制研究中心，山东省分析测试中心，山东 济南 250014)

摘要：建立了用核磁共振内标法准确、快速测定乙基麦芽酚对照品含量的方法。采用Varian Inova 600 MHz超导核磁共振波谱仪，以氘代DMSO-d6为溶剂、苯甲酸为内标，在25 ℃条件下采集乙基麦芽酚和苯甲酸混合物的核磁共振氢谱。以乙基麦芽酚中化学位移在δH6.34和苯甲酸中化学位移在δH7.95的质子信号峰为定量峰，其峰面积y(As/Ar)与其质量比x(ms/mr)的线性回归方程为y = 0.805 8x+0.087 3，相关系数R=0.999 0。测得3批乙基麦芽酚的质量分数分别为99.47%，99.34%和99.51%。在没有对照品的情况下，核磁共振内标法可用于乙基麦芽酚对照品的含量测定和质量控制,同时可作为一种在没有对照品的情况下化合物含量测定的有效方法，为测定其他化学对照品的含量提供一定的参考。

关键词：核磁共振；乙基麦芽酚；含量

Content determination of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone

乙基麦芽酚(2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone)是一种安全无毒、用途广、效果好且用量少的理想食品添加剂，增香效果是甲基麦芽酚的6倍，24份香豆素相当于1份乙基麦芽酚[1]。1970年,世界卫生组织及联合国粮农组织已经确认乙基麦芽酚为食品添加剂[2]。我国《食品添加剂使用卫生标准》GB12487-2010[3]也确认其可作为食品合成香料使用。乙基麦芽酚现已广泛应用于化妆品、食品、饮料、牙膏、香烟和药品，是一种安全性高、无毒、增香、增甜、保香和掩盖异味的常用食品添加剂。现代研究发现，乙基麦芽酚可以控制人体铁和铝的含量水平[4]，在抑制人体过氧化物、抗衰老方面也有一定效果[5]。目前乙基麦芽酚测量方法有高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、电化学法、荧光法和气相色谱法等[6-11]。这些分析测试方法有的操作繁琐，有的灵敏度不高，存在准确性、可比性和溯源性不是很好的缺陷，并且各种测量方法均需要与标准品对照。

目前，定量核磁共振技术(QNMR)广泛应用于化学、生物、食品、农业及军事等领域[12]，在医药领域用于对化学药品、体液样品、中药与植物提取物等的定量分析[13-16]。QNMR技术在化合物纯度定值、含量测定方面具有准确度高、灵敏度高、分析速度快以及样品用量少的特点，适合于样品的含量测定。核磁共振定量分析法先后被美国药典、英国药典以及欧洲药典作为某些药品的标准测量方法收录[17-19]，中国药典也在2010版收录了该方法[20]。但目前没有运用QNMR技术对乙基麦芽酚含量测定的相关报道。本研究采用核磁共振内标法测定了乙基麦芽酚对照品的含量，建立了在无需使用对照品的情况下对乙基麦芽酚进行质量控制和含量测定的方法。

1材料与方法

1.1实验仪器

Inova 600 MHz核磁共振波谱仪(美国Varian公司)。

1.2试剂与样品

氘代二甲亚砜(99.9%氘代，美国CIL公司)，苯甲酸(质量分数99.2%，批号101253928，美国Sigma 公司)，乙基麦芽酚对照品。乙基麦芽酚和苯甲酸的结构见图1。

图1　乙基麦芽酚和苯甲酸的化学结构Fig.1　Chemical structures of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and benzoic acid

1.3核磁共振采集条件

测定温度：25 ℃，环境湿度：35%，谱宽：15 000.9 Hz，FT size：131 072，累加次数：64，采集时间：6 s，观察频率：600 MHz。

1.4方法

乙基麦芽酚对照品和苯甲酸对照品精密称取适量，分别放置在核磁共振样品管中(d=5 mm)，加入氘代试剂适量(二甲亚砜)，振摇使样品完全溶解，即得样品溶液。在1.3的核磁共振采集条件下，调整参数，然后进行匀场、核磁数据采集，测得样品核磁共振氢谱。分别对乙基麦芽酚和苯甲酸的定量峰进行积分，运用以下公式对样品质量分数进行计算

其中，As：乙基麦芽酚峰面积积分值，Ar：苯甲酸峰面积积分值，ns：乙基麦芽酚定量峰包含的质子数，nr：苯甲酸定量峰包含的质子数，ms：乙基麦芽酚的质量，mr：苯甲酸的质量，Wr：苯甲酸的质量分数，Ms：乙基麦芽酚分子质量，Mr：苯甲酸的分子质量。

2结果与讨论

2.1内标物、氘代试剂和特征性定量峰的选择

核磁共振内标法在内标物选择上要保证不干扰被测物质的信号峰，本研究选择苯甲酸为核磁定量内标物。苯甲酸的核磁共振氢谱显示，其2位和6位质子信号为δH7.95，可以与其他氢信号完全分开[21]。测试溶剂的选择也至关重要，既要保证被测物质与内标物在溶剂中溶解性好，又要确定氘代溶剂对测定结果不能造成干扰。本次研究选用氘代二甲亚砜为测试溶剂，氘代二甲亚砜对乙基麦芽酚和苯甲酸溶解性都非常好，并且氘代二甲亚砜在核磁共振氢谱上溶剂峰为δH2.49，对乙基麦芽酚与苯甲酸的信号峰没有干扰，不会影响含量测定结果。

在核磁共振内标法定量分析之前，已通过核磁共振一维谱和二维谱对乙基麦芽酚的信号峰进行了逐一归属；在乙基麦芽酚的核磁共振氢谱上可以看到5位的质子信号化学位移为δH6.34[21]，与其他核磁氢信号完全分开，可作为乙基麦芽酚定量分析的特征峰。核磁共振内标法测定乙基麦芽酚含量的氢谱如图2所示。

图2　核磁共振内标法测定乙基麦芽酚含量的氢谱Fig.2　1H-NMR spectrum of QNMR determined 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone

2.2线性关系

按照1.4实验方法，配置6种不同浓度的待测样品溶液，依照1.3的核磁共振采集条件，测定每种浓度样品的核磁共振氢谱，并分别对乙基麦芽酚和苯甲酸特征信号峰的峰面积进行积分，每个样品积分3次，取3次积分的平均值作为乙基麦芽酚的积分面积，具体结果如表1所示。

表1　乙基麦芽酚和苯甲酸的质量及氢谱峰面积积分值

注：ms为乙基麦芽酚质量，mr为苯甲酸的质量，As为乙基麦芽酚峰面积积分值，Ar为苯甲酸峰面积积分值。

将x作为乙基麦芽酚与苯甲酸质量的比值，y作为乙基麦芽酚与苯甲酸的积分面积的比值，进行线性关系计算，求得线性回归方程：y= 0.805 8x+0.087 3(R= 0.999 0，n=6)。计算结果表明，所建立的以苯甲酸为内标物测定乙基麦芽酚含量的方法，线性关系良好。

2.3稳定性实验

抽取表1中的5号样品，放置在室温下，按照上述1.4的实验方法，分别在0、4、8、12、16 h后测定，对乙基麦芽酚进行稳定性测试，计算得出RSD为0.66%。实验说明该样品溶液在16 h内稳定性良好。

2.4重复性实验

抽取表1中的5号样品，在相同的实验条件下按照1.4的实验方法重复测定6次，以乙基麦芽酚与苯甲酸定量特征峰的积分面积比值进行计算，得出RSD为0.32%。结果说明该方法具有良好的重现性。

2.5采样次数的选择

增加样品的采样次数，可以提高信号性噪比，样品峰的积分数据更加稳定。本次实验分别设置采样次数为4、8、16、32、64、128，对样品分别进行扫描测试。通过实验得出，采样次数的增大对乙基麦芽酚和苯甲酸积分面积的比值基本没有影响，而且增加了样品分析时间，64次采样次数足以满足本实验对精密度的要求，故设置采样次数为64。

2.6加样回收率实验

分别精密称取乙基麦芽酚样品4、5、6 mg各2份，精密称取乙基麦芽酚标准品6、5、4 mg各2份，并将标准品分别加入到乙基麦芽酚样品中，依照1.4的实验方法依次测定待测样品的核磁共振氢谱，依据回收率公式：回收率(%)= [测得含量-样品含量]/标准品添加量[22]，计算得出乙基麦芽酚的样品回收率，实验结果如表2所示。

表2　加样回收率测试结果(n=6)

2.7样品测定

取3个批次的乙基麦芽酚对照品，采用HPLC法测定其相对质量分数，同时依照上述1.3实验条件和1.4实验方法，测定上述3个批次乙基麦芽酚对照品与苯甲酸特征峰的峰面积，按照1.4的计算公式计算，可得乙基麦芽酚对照品的绝对质量分数，测定结果如表3所示。通过表3数据对比可得出，运用高效液相归一化法得到的乙基麦芽酚的质量分数略高于核磁共振内标法，主要是由于核磁共振内核法测定时去除了乙基麦芽酚的吸收水分，只测定了绝对含量[22]。

表3　测定乙基麦芽酚对照品含量的实验结果(质量分数/%)

3结论

上述实验采用磁共振内核方法，以氘代DMSO为溶剂，苯甲酸为内标物，建立测定乙基麦芽酚对照品含量的方法。实验结果表明，采用磁共振内核方法对乙基麦芽酚含量进行测定，线性关系、重复性和稳定性均良好。此方法具有原子核吸收共振面积只与原子数目有关、不受外界环境影响、测量时无需使用标准品对照、无需引入校正因子、样品使用量少、适用范围广、操作简单、分析速度快，含量测定和结构鉴定可同步完成的特点，与传统的测量方法相比，具有较大的优势。因此，磁共振内核法可以作为对照品含量测定的一种新方法，广泛运用于其他化学对照品含量的测定。

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【中药与天然活性产物】

reference with1H-NMR spectroscopy

WANG Zhao-ping1,ZHU Heng1,WANG Xiao2,GENG Yan-ling2,

XIAN Yun-xia1,YU Jin-qian2*

(1.Shangdong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China;2.Process Control Research

Center of Traditional Chinese Medicine, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China)

Abstract∶We established a rapid and accurate method to determine the content of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone reference by quantitative nuclear magnetic resonance.We acquired1H-NMR spectra of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and benzoic acid mixture at 25 ℃ with Varian Inova 600 MHz spectrometer, DMSO-d6as solution, and benzoic acid as internal standard.We determined the contents of 3 batches of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone were 99.47%, 99.34% and 99.51% with proton signals at δH6.34 of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and δH7.95 of benzoic acid as quantification peaks, whose linear regression equation of peak areas ratio y(As/Ar) and mass ratio x(ms/mr) was y = 0.8058x+0.0873 and correlation coefficient was 0.999 0.The method can be applied to content determination and quality control of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone reference without any references.It can also provide references for content determination of other substances.

Key words∶QNMR; 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone;content

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.007

中图分类号：R284.1

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2015)04-0030-05

通讯作者*,于金倩(1987-)，女，助理研究员，博士，研究方向为天然产物提取分离及标准样品制备。Email:yujinqian87528@126.com

作者简介：王召平(1988-)，男，硕士研究生，研究方向为天然产物分离与纯化。

基金项目：山东省分析测试中心所 (CS201305)

收稿日期：2015-05-15