川芎嗪对乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响及机制研究

来岳标汪玉琪姚庆华

·论著·

川芎嗪对乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响及机制研究

来岳标1汪玉琪1姚庆华2

目的 观察川芎嗪（TMP）对乳腺癌MCF7细胞株凋亡的影响及其可能的机制。方法建立乳腺癌MCF7细胞体外培养体系。MTT法检测不同浓度TMP对乳腺癌MCF7细胞增殖的影响，流式细胞仪、电子显微镜和免疫印迹法分别检测各组细胞凋亡比例，观察细胞凋亡特征，检测MAPK信号通路相关基因如ERK、p38和JNK表达水平。结果予0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL TMP处理48h后，MCF7细胞抑制率分别为（2.95±2.45）%、（18.62±4.60）%、（31.15±3.58）%、（47.13± 4.15）%和（62.14±5.23）%；0、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL的TMP处理48h， MCF7细胞凋亡率分别为1.58%、3.29%、13.21%、19.23%、29.38%，形态学观察显示典型的凋亡特征。TMP处理后细胞中p-p38和p-JNK蛋白表达以剂量依赖的方式增加，而p-ERK以剂量依赖的方式减少。结论 TMP能诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡，其机制可能与激活MAPK信号通路有关。

乳腺癌；MCF7；凋亡；川芎嗪；MAPK

与其他大多数国家一样，乳腺癌已成为中国女性最常见的癌症。中国乳腺癌每年新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2%和9.6%[1]。TMP是从中药川芎中提取的生物碱，它具有多种生物学活性。临床上常用于治疗脑血管疾病及肾脏病等[2]。近年来，多项研究证明，TMP可以应用于抗肿瘤的治疗[3-5]。但是TMP发挥其抗肿瘤作用的分子机制尚不完全清楚。以往的研究[6]表明，TMP可以诱导肿瘤细胞凋亡。在生理和病理条件下，细胞凋亡是一种代谢的过程，具有特定的形态特征，包括细胞皱缩，染色质浓缩，凋亡小体的形成[7-8]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路是由不同的细胞外刺激激活，导致广泛的细胞反应，包括细胞凋亡、增殖和炎症。已经确定细胞外信号调节激酶（ERK）、p38和应激活化蛋白激酶（SAPK）/c－Jun（JNK）是三个主要的MAPK途径[9－11]。然而，TMP对于MCF7细胞分子水平的作用仍然知道的很少。本实验通过流式细胞仪、电子显微镜和免疫印迹法检测TMP作用后乳腺癌MCF7细胞凋亡水平以及MAPK信号通路相关蛋白表达的影响，探讨TMP体外诱导MCF7细胞凋亡的作用及其分子机制，为TMP的进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与细胞培养 人乳腺癌MCF7细胞株由浙江大学医学院附属邵逸夫医院实验室提供。细胞在37℃、5%CO2含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基中培养，待细胞生长至80%融合时进行传代，用0．25%胰酶常规消化，1:3～1:5比率进行传代。取对数生长期细胞进行实验。

1.2 药 物 注射用盐酸川芎嗪（商品名：瑞科林，北京四环科宝制药有限公司，规格：80mg/支）。

1.3 试剂及仪器 抗体包括Action，ERK，p38，JNK，P－ERK，P－P38，P－JNK，均从Sigma购买（圣路易斯，美国）。U0126（ERK抑制剂），SB203580（p38抑制剂）及SP600125（JNK抑制剂）从Sigma购买（圣路易斯，美国）。BCA蛋白浓度测定试剂盒从碧云天公司购买（上海，中国）。透射电镜由浙江大学提供（浙江，中国），流式细胞仪及本研究所需的其余仪器设备由浙江大学医学院附属邵逸夫医院提供（浙江，中国）。

1.4 实验方法

1.4.1 MTT法检测TMP对乳腺癌MCF7细胞增殖作用 取对数生长期的MCF7细胞，细胞浓度调整至4×104个/mL，然后将上述细胞悬液加入96孔板，每孔200μL。当细胞贴壁后，各实验组分别加入含0．25、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL的 TMP空白血清DMEM 200μL。每个药物浓度设置五个平行孔。在作用24、48、72h后分别加入20μL的MTT液，然后再培养4h后仔细吸除上清；每孔均匀加入150μL二甲基亚砜。用多模式微孔板阅读机器测定吸光度（A），检测参考波长为570、630nm，计算细胞生长抑制率，实验重复3次。

1.4.2 PI单染色流式细胞仪检测TMP对乳腺癌MCF7细胞周期的作用 MCF7细胞接种于培养瓶中，分对照组及0．50mg/mL、1．00mg/mL、1．50mg/mL、2．00mg/mL浓度TMP干预组。药物作用48h后用0．25%的胰酶消化，收集细胞。制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×106/mL。取1mL细胞，1000rpm 4℃离心10min，弃上清液。各管中加入195μL Annexin－Ⅴ－FITC结合缓冲液，轻轻重悬细胞。加入5μL Annexin－Ⅴ－FITC，轻轻混匀。室温避光孵育 10min。1000rpm离心5min，弃上清。各流式管中加入195μL结合缓冲液，轻轻重悬细胞。加入5μLPI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置10min。流式细胞仪上测定，数据由计算机处理并打印。实验重复3次。

1.4.3 细胞形态观察 MCF7细胞接种于培养瓶中。培养24h后小心吸弃培养上清液。实验分为对照组和TMP干预组，其中TMP干预组加入含1．00mg/mL TMP血清培养液3mL，而对照组仅加等量的空白血清培养液，各自培养48h后小心吸弃培养上清液。取对照组及1．00mg/mL TMP干预满48h的MCF7细胞，用0．25%的胰酶消化，离心收集细胞。用2．5%的戊二醛固定2h，1%锇酸再固定30min，乙醇一丙酮梯度脱水，包埋，常规超薄切片，透射电镜下观察。

1.4.4 免疫蛋白印迹分析 不同浓度TMP处理的MCF7细胞样品在RIPA裂解缓冲液匀浆。蛋白浓度用BCA法检测。印迹膜封闭于5%牛血清白蛋白，随后分别暴露于特定的一抗：ERK（1:2000），p38（1: 2000），JNK（1:2000），p－ERK（1:2000），p－p38（1: 2000），p－JNK（1:2000）。用HRP标记的第二抗体孵育后，电化学发光试剂处理膜，然后暴露于放射自显影仪中进行检测。

2 结果

2.1 TMP对MCF7细胞增殖的抑制作用 不同浓度的TMP作用MCF7细胞24～72h后，MTT比色法测得的各组细胞抑制率显示示，TMP能明显抑制MCF7细胞的增殖，TMP 0．25、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL处理48h，对MCF7细胞生长的抑制率分别为（2．95± 2．45）%、（18．62±4．60）%、（31．15±3．58）%、（47．13± 4．15）%和（62．14±5．23）%，作用呈剂量和时间依赖性。见图1（202页）。

2.2 细胞流式实验检测TMP对MCF的凋亡作用 0、0．50、1．00、1．50、2．00mg/mL TMP处理细胞48h后，AV+/PI－的数量（细胞凋亡）分别为1．58%、3．29%、13．21%、19．23%、29．38%，呈现出浓度依赖性，各组间比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。结果表明，TMP可诱导MCF7细胞凋亡。见图2（202页）。

2.3 TMP作用前后MCF7细胞形态学的改变 正常情况下MCF7细胞在倒置显微镜下观察生长良好，形状不规则，呈梭形或多角形，并可融合形成集落，生长有巢状现象，细胞核大，核异型，核质比高，可见异常核分裂相。TMP作用前后透射电镜，结果显示，对照组MCF7细胞形态饱满，细胞核内染色质分布均匀，细胞器清晰,见图3A（封三）。1．0mg/mL TMP作用48h后，MCF7细胞发生了凋亡细胞形态学特征性变化，细胞体积缩小，细胞核固缩，核染色质密集，胞浆浓缩，胞质内充满大小不等的空泡，见图3B（封三）。

2.4 MAPK信号通路在TMP诱导细胞凋亡中的作用 为探讨MAPK信号通路是否参与了TMP诱导的细胞凋亡，检测MAPK信号通路的磷酸化水平。1、2mg/mL的TMP处理细胞48h后，用Western blot检测ERK、p38和JNK的表达。TMP处理MCF7细胞后磷酸化ERK的表达量持续降低，磷酸化p38和磷酸化JNK表达增加；而JNK和p38和ERK的总量变化不大，见图4（封三）。这些结果表明，TMP减少了ERK的活化，促进p38、JNK的活化，而这些变化是与细胞凋亡密切相关的。为确定是否这些激酶可诱导细胞凋亡，影响细胞MAPK的活化，用MAPK通路抑制剂U0126、SB203580和SP600125分别处理MCF7细胞1h后加入1mg/mL TMP处理48h。我们发现，ERK抑制剂U0126处理1h后ERK的磷酸化水平增加明显，而p38抑制剂SB203580处理细胞1h后p38的磷酸化水平降低。同样，JNK的磷酸化也在细胞运用SP600125处理后降低，见图5（202页）。

3 讨 论

细胞凋亡是一种基因编码的导致细胞开启自杀程序的结果，具有形态和生化变化，可见染色质边集，核碎片的产生。本研究中，TMP诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡呈剂量和时间依赖性，已由流式检测中PI 和Annexin V的变化说明。实验中通过电子显微镜观察到细胞凋亡的形态学变化，直接证明MCF7细胞的凋亡。与未经处理的细胞相比，1mg/mL的TMP处理后细胞微绒毛消失，细胞收缩，核碎片含有的染色质浓缩和膜泡，细胞质边集，呈典型的凋亡细胞形态的变化。

MAPK信号通路在多种细胞外信号刺激细胞表面激活细胞核内的基因并作出相应的响应过程中发挥着重要的作用。通常是由有丝分裂原刺激的ERK参与细胞的增殖、分化和增殖活性。JNK和p38激酶主要由细胞外刺激产生应答。这些激酶的激活导致细胞的反应取决于细胞类型的变量。一些研究表明，双重作用的细胞反应中的MAPK似乎是特定类型的细胞凋亡[12－14]。MAPK活性在细胞凋亡中的确切作用仍有待进一步研究[15－19]。该研究发现，TMP处理24h后，磷酸化JNK和磷酸化p38含量有明显的剂量依赖性增加，但磷酸化ERK有一个明显的降低，且呈剂量依赖性。研究结果表明，TMP处理后的p38、JNK 和ERK均有明显的变化，而MAPK通路川芎嗪诱导MCF7细胞的凋亡中扮演着重要的角色。

综上所述，本研究表明TMP处理后能引起乳腺癌MCF7细胞凋亡，同时TMP可以使p38、JNK活化，表明MAPK通路在TMP诱导的MCF7细胞的凋亡中发挥重要作用。

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（收稿：2015-07-08 修回：2015-09-28）

Effectof Tetramethypyrazine on Breast Cancer MCF7 CellApoptosis and The Underlying Mechanism

LAIYuebiao1,WANG Yuqi1,YAO Qinghua2.1 The First Clinical Medical College,Zhejiang Traditional Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China;2 Department of Integrated Chinese and Western Medicine,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou（310022）,China

ObjectiveTo study the effectof tetramethypyrazine on breast cancer MCF7 Cellapoptosis and the underlying mechanism.MethodsHuman breast cancer MCF7 cellscultured in vitrowere used to detect the inhibition rate of tetramethypyrazine in different concentrations（0.25,0.50,1.00,1.50,2.00mg/ml）by MTT assay.The flow cytometry,electron microscope and western blot method were used to detect the apoptosis ratioofdifferent groups;the apoptosis characteristics were observed;andthe level of MAPK signal pathway related genes ERK, p38and JNK,were determined.ResultsAfter treatment with tetramethypyrazine for 48h,the inhibition rate of human breast cancer MCF7 cells in 0.25,0.50,1.00,1.50,2.00mg/ml groups were（2.95±2.45）%,（18.62±4.60）%, （31.15±3.58）%,（47.13±4.15）%,and（62.14±5.23）%,respectively;the apoptosis ratio of MCF7 cells were1.58%, 3.29%,13.21%,19.23%,and 29.38%.Morphological observation showed typical apoptosis characteristics of MCF7 cells after tetramethypyrazine treatment.The protein expression of p-p38and p-JNK increased in a dose-dependent manner,but p-ERK reduced.ConclusionTetramethypyrazinecan induce the apoptosis of breast cancer MCF7 cells,and its mechanism may be related to activation of MAPK signal pathway.

apoptosis;MCF7;apoptosis;tetramethypyrazine;MAPK

1浙江中医药大学第一临床医学院（杭州 310053）；2浙江省肿瘤医院中西医结合科（杭州 310022）

姚庆华，TEL：13588899111；E-mail：danfer1001@163.com