共聚焦激光显微内镜在炎症性肠病中的应用新进展

沈海燕 虞朝辉 陈春晓

●综 述

共聚焦激光显微内镜在炎症性肠病中的应用新进展

沈海燕 虞朝辉 陈春晓

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，BD）主要包括2种慢性肠道疾病—溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn′s disease，CD）。近期研究结果显示，IBD的发生是携带易感基因的人体对共生微生物一次不恰当的炎症反应所致[1-2]。IBD在我国的发病率呈上升趋势[3]，内镜检查对诊断、监测和评估疾病活动和程度起非常重要的作用。共聚焦激光显微内镜（confocal laser endomicroscopy，CLE）可使体内组织黏膜层在内镜下放大1 000倍[4]，实时观察黏膜细胞和亚细胞水平的断层扫描图像，分析细胞核、腺体、毛细微血管的状态，指导内镜下靶向活检及组织学诊断；CLE可发现发育异常的病变并预测肿瘤、炎症的高精度组织学变化；此外CLE还能预测生物制剂的治疗反应，已成为一种可以识别体内炎症黏膜细胞、评估黏膜炎症活动的新方法[5]。

1 CLE的工作原理

首先，激光源发出488nm波长的激光束，激发被检组织中的荧光物质，不同方向的荧光物质通过光源针孔及透镜聚焦在观察平面的某一点，该点反射光经同一透镜聚焦于观察针孔形成点像，探测器通过针孔接收成像。这种成像方式之所以被称为共聚焦成像是由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上。当激光逐点扫描检测组织时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像并转化为数字信号传输至计算机，最终整个焦平面的共聚焦图像在屏幕上清晰聚合。将焦平面依次设于检测组织的不同层面上，即可逐层获得组织相应的光学横断面图像，称为“光学切片”。CLE在内镜检查的同时还可以获得黏膜不同层面的“光学切片”，因此被誉为“光学活检”[6]。

2 CLE使用的对比剂

CLE是基于外源荧光剂应用照明后组织成像显影的。绝大多数研究常用10%荧光素钠作为系统对比剂，静脉注射数秒内即可显影，可在镜下高分辨率清晰地显示细胞及亚细胞水平的毛细血管形态、血管结构、细胞形态等。但荧光素钠对细胞核不显影，故盐酸吖啶黄作为一种局部荧光剂，常被作为系统检查中细胞核显影的补充使用剂。

3 CLE在炎症性肠病中的应用

3.1 在UC中的应用 CLE可通过连续内镜下观察评估细胞、腺窝、血管结构，从而实时评估UC患者黏膜愈合状况。Kiesslich等[7]、Watanabe等[8]已将CLE技术应用于UC患者肠黏膜的实时炎症活动性评估中。在UC中，腺窝结构的改变是最主要的变化，主要表现为腺窝开口扩大、腺窝无规律排列、腺窝间隔变大、腺窝结构破坏及/或者腺窝融合、腺窝脓液伴荧光剂渗漏入内腔（导致内腔比周围上皮细胞显影更加明亮）。微血管的病变主要表现于膨胀、扭曲的分支血管。用CLE拍摄的图像所提供的信息相当于常规组织学检查，且对于UC患者能比常规内镜检查更好地区分活动和非活动期状态[9-10]。

上皮细胞脱落是消化道黏膜正常生理过程，但过快的上皮细胞脱落可能导致黏膜屏障变化，每个细胞的脱落都会造成上皮间隙的形成[11],通过CLE观察黏膜局部屏障功能的相关研究目前越来越受到重视。通过对肠黏膜屏障功能的评估可预测UC的复发，Kiesslich等[10]提出在普通白光内镜下黏膜愈合，但CLE观察下存在局部黏膜屏障功能障碍的患者复发率更高，并且观察回肠末端CLE下黏膜变化更有助于预测疾病复发风险。

此外，CLE在定位活检，尤其是减少无用的活检和提高发育不良细胞的早期检出率是有意义的。结肠直肠癌（CRC）是UC患者严重的并发症，CRC占UC患者死因的10%～15%[12]。Jess等[13]报道的荟萃分析表明，在随访长达14年的人群队列研究中，1.6%的UC患者被诊断出患有CRC。UC患者患CRC的风险增加2.4倍。男性、年幼时即确诊UC及广泛的结肠炎等因素均增加CRC的风险。因此长期UC患者需定期复查肠镜以检测有无早期细胞发育不良及癌变情况。CLE与染色内镜（CE）联合检查相对于白光内镜检查，活检组织数量可明显减少，CE先判定需注意变化部位，然后再利用CLE精确判定组织结构变化。常规UC患者白光内镜筛查有无组织学异常变化需活检组织40～50块，通过上述方法，每例患者虽然平均取活检组织仅3.9块，但是发育异常的检出率提高了4倍以上[14]。

3.2 在CD中的应用 既往内镜检查多参照CD内镜指数(CDEIS)评估CD活动性。在一项54例CD病例对照研究中，运用CLE进行CD活动度及黏膜愈合的评估，提出依据黏膜描述制定的CLE下CD活动度评分标准（CDEAS）[15]，内容包括隐窝、微小糜烂的出现、固有层血管暴露、杯状细胞数量的改变、固有层细胞渗漏。因此可实时评估CD活动度，评判CD疾病进程，并可评估对药物治疗的反应。

抗肿瘤坏死因子（anti-TNF）药物是难治性CD的主要治疗药物，但其价格昂贵。能否运用CLE技术预测anti-TNF治疗疗效从而提高该药应用的效价比已日益得到重视。相关研究发现TNF-α会增加细胞脱落及间隙形成。通过CLE的动态观察发现，注射了TNF-α的小鼠出现大幅度细胞脱落，导致间隙屏障功能破坏。细胞脱落部位屏障功能的丧失导致上皮细胞通透性增加被推测为IBD一项重要发病机制[16]。在CLE内镜下检测肠道肿瘤坏死因子(mTNF)活跃的免疫细胞，结果表明拥有高mTNF阳性细胞患者在后续anti-TNF的治疗中，在第12周的短期应答率达92%，显著高于低mTNF阳性细胞患者15%的应答率。上述临床反应的患者持续了1年的随访，并显示mTNF阳性细胞活跃度的高低与在后续内镜检查中黏膜愈合情况相关[17-18]。

4 小结和展望

既往IBD患者是否存在黏膜异常需要经过组织学鉴定，现在该工作通过CLE也可完成。CLE可能会更有效的节约结肠相关性肿瘤检测的可观病理学成本，但该过程往往耗时且操作设备昂贵，而且它需要额外的组织病理学培训，操作过程中一般需要2位专业病理学专家参与才能更准确判定组织病变的状态，虽然可运用于IBD患者的癌症监测，但因目前拥有该设备的机构较少，所以较难普及。

结合目前CLE相关主要研究内容，今后该技术应用发展有望集中在以下方面：（1）黏膜愈合已成为IBD患者的治疗目标，随着CLE发展，黏膜愈合的概念可能要被重新定义。（2）对于反复难治性UC患者可根据CLE下黏膜层细胞结构及功能的实时情况预测病情发展及复发风险，以期通过检测黏膜愈合情况作出药物减撤及临床治疗方案的调整。（3）对CD患者，今后有望通过在CLE下观察mTNF阳性细胞的活跃度预测anti-TNF治疗是否有效，在提高治疗方案制定的准确性同时也提高经济效益。（4）对于反复、重症炎症活动的高风险IBD患者，可运用CLE提高CRC检出率，并减少无意义的过度组织活检损伤。

随着CLE的不断发展，临床期待借助其观察黏膜屏障分子水平的变化，提高早期CD的确诊率，提前发现UC患者CRC的癌前病变，从而早期控制疾病发展，降低致残风险。同时，借助CLE通过分子水平评估炎症活动程度，以指导临床药物治疗。

[1] Abraham C,Cho J H.Inflammatory bowel disease[J].N Engl J Med,2009,361(21):2066-2078.

[2] Plevy S E,Targan S R.Future therapeutic approaches for inflammatory,boweldiseases[J].Gastroenterology,2011,140(6):1838-1846.

[3] ZHAO J,Ng S C,LEI Y,et al．First Prospective,Population-based Inflammatory Bowel Disease Incidence Study in Mainland of China:The Emergence of"western"Disease[J].Inflamm Bowel Dis, 2013,19(9):1839-1845.

[4] Kiesslich R,Burg J,Vieth M,et al.Confocal laser endoscopy for diagnosing intraepithelialneoplasias and colorectalcancer in vivo [J].Gastroenterology,2004,127(3):706-713.

[5] Tontini G E,Vecchi M,Neurath M F,et al.Advanced endoscopic imaging techniques in Crohn's disease[J].J Crohns Colitis,2014,8 (4):261-269.

[6] 马燕燕,虞朝辉,厉有名.共聚焦激光显微内镜在上消化道疾病中的应用新进展[J].浙江医学,2013,15(16):1537-1539.

[7] Kiesslich R,Goetz M,Lammersdorf K,et al.Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelialneoplasia in ulcerative colitis[J].Gastroenterology,2007,132(3): 874-882.

[8] Watanabe O,Ando T,Maeda O,et al.Confocal endomicroscopy inpatients withulcerative colitis[J].J GastroenterolHepatol.2008,23: S286-S290.

[9] LIC Q,XIE XJ,YU T,et al.Classification of inflammation activity in ulcerative colitis by confocallaser endomicroscopy[J].Am J Gastroenterol,2010,105(6):1391-1396.

[10] Kiesslich R,Duckworth C A,Moussata D,et al.Localbarrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease[J].Gut,2012,61(8): 1146-1153.

[11] Watson AJ,Chu S,Sieck L,et al.Epithelialbarrier function in vivo is sustained despite gaps in epitheliallayers[J].Gastroenterology,2005,129(3):902-912.

[12] Wanders L K,Dekker E,Pullens B,et al.Cancer Risk After Resection of Polypoid Dysplasia in Patients With Longstanding Ulcerative Colitis:A Meta-analysis[J].Clin Gastroenterol Hepatol, 2014,12(5):756-764.

[13] Jess T,Rungoe C,Peyrin-Biroulet L.Risk of colorectalcancer in patients with ulcerative colitis:a meta-analysis of population-based cohort studies[J].Clin GastroenterolHepatol,2012,10 (6):639-645.

[14] Kiesslich R,Neurath M F.Chromoendoscopy in inflammatory bowel disease[J].Gastroenterol Clin North Am,2012,41(2): 291-302.

[15] Neumann H,Vieth M,Atreya R,et al.Assessment ofCrohn's disease activity by confocal laser endomicroscopy[J].Inflamm BowelDis,2012,18(12):2261-2269.

[16] Kiesslich R,Goetz M,Angus E M,et al.Identification of epithelial gaps in human small and large intestine by confocal endomicroscopy[J].Gastroenterology,2007,133(6):1769-1778.

[17] Atreya R,Neumann H,Neufert C,et al.In vivo imaging using fluorescent antibodies to tumor necrosis factor predicts therapeutic response in Crohn's disease[J].NatMed,2014,20(3):313-318.

[18] Kattah M G,Mahadevan U.Confocal laser endomicroscopy for membrane-bound tumor necrosis factor predicts response to therapy in Crohn's disease[J].Gastroenterology,2015,148(5): 1067-1069.

2015-05-12）

（本文编辑：李媚）

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院消化内科（沈海燕系在职研究生，现在嘉兴市第二医院消化内科工作）

陈春晓，E-mail：13906523922@126.com