分子线性探针测定法在结核病诊断中的研究进展

陈琛 马远征



分子线性探针测定法在结核病诊断中的研究进展

陈琛 马远征

耐药Mtb的日益增多和常规诊断技术的迟滞是结核病诊断延迟和预后不佳的重要原因。分子线性探针测定法是近年来兴起的一种PCR技术，包括比利时Innogenetics 公司分子线性探针法(INNO-LPA)、Genotype MTBDR分子线性探针法、自身免疫性诊断Mtb耐药分子线性探针法(the autoimmun diagnostika TB resis-tance line probe assay，AID-LPA)和反向杂交Mtb耐药分子线性探针法(the REBA MTB-rifa®assay，REBA-LPA)。分子线性探针测定法既可以快速、准确诊断结核病，又可检测出常见耐药基因，而且其敏感度及特异度也很高。作者就近几年来分子线性探针技术的研究进展进行综述。

结核； 分子探针； 诊断

2014年，WHO报道全球约 1/3人口感染过Mtb，其中约1/10感染者最终发展为结核病；结核病仍然是世界上最致命的传染性疾病之一[1]。Mtb常规检测方法敏感度低、耗时长，易造成诊断延误。近年兴起的分子线性探针技术(molecular line probe assay, LPA)已得到了广大研究人员的认可，可确保更多的结核病患者得到快速、准确的诊断和治疗[1]。现就LPA在结核病诊断中的应用进行综述。

一、LPA简介

LPA又称PCR-单链探针反向杂交试验，是通过应用生物素标记的特异引物进行靶核酸(DNA)的扩增，并将扩增产物变性后与固定在尼龙膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶联免疫显色法显示结果，1次杂交可以检测多种靶序列。LPA是一类检测方法的统称，具体包括比利时Innogenetics 公司分子线性探针法(INNO-LPA)、GenoType法、自身免疫性诊断Mtb耐药分子线性探针法(the autoimmun diagnostika TB resistance line probe assay，AID-LPA)和反向杂交Mtb耐药分子线性探针法(the REBA MTB-rifa®assay，REBA-LPA)[2]。

1.INNO-LPA：INNO-LPA是最早应用临床的LPA，由比利时Innogenetics公司于2000年推出，可用于检测Mtb临床分离株和涂阳痰标本及其利福平(rifampicin, RFP)耐药[3]。在结核病高发国家，90%的RFP耐药Mtb也同时存在异烟肼 (isonicotiny hydrazide, INH)耐药[4]。因此，RFP耐药可作为耐多药结核(multi-drug resistant tuberculosis, MDR)的替代标志[5]，故而INNO-LPA可用于检测MDR。该法需按照说明书手动操作，可在24～72 h内报告结果。

2.GenoType法：GenoType法为一类方法，均为德国Hain Lifescience公司发明。该公司2004年推出的Genotype MTBDR 分子线性探针法(the Genotype MTBDR LPA，MTBDR-LPA)可检测Mtb临床分离株和涂阳呼吸系统标本，并可检测RFP耐药、高水平INH耐药[6]。2008年推出的Genotype MTBDRplus分子线性探针法(the Genotype MTBDRplus LPA，MTBDRplus-LPA)除可以检测Mtb及其RFP耐药外，还可检测低水平INH耐药[6-9]。此改进可使INH耐药的检出率提高10%～20%，也相应增加了耐多药结核病的检出率[10]。2012年推出的Genotype MTBDRplus 2.0分子线性探针法(the Genotype MTBDRplus 2.0-LPA，MTBDRplus 2.0-LPA)还可直接检测涂阴痰标本，也实现了自动化操作[11]。随后推出的Genotype TBDRsl分子线性探针法(the Genotype TBDRsl LPA，TBDRsl-LPA)检测上述指标外，还可分别预测氟喹诺酮类药物、阿米卡星或卡那霉素，以及乙胺丁醇耐药[12]。此类检测法可在6～9 h内报告结果，但除MTBDR plus 2.0-LPA实现自动化外，余均需手动操。

3.AID-LPA：此法由德国Autoimmun Diagnostika公司发明，分为INH/RFP、氟喹诺酮类/乙胺丁醇、卡那霉素/阿米卡星/链霉素等3个检测模块，可分别检测INH及RFP耐药，氟喹诺酮类药物耐药及乙胺丁醇耐药，卡那霉素、阿米卡星及链霉素耐药[13]。此法需手动操作，可在24 h内获得结果。

4.REBA-LPA：此法由韩国YD Diagnostics公司发明[8]，可检测临床分离株及涂阳痰标本中的Mtb及其低水平RFP耐药情况，需手动操作。该技术自2013年首次亮相后就再未见相关报道。

二、LPA在肺结核检测中的应用

各种LPA法都可对疑似耐药肺结核患者进行早期快速检测，且其敏感度及特异度较高。预测耐药基因表型的关键在于对耐药基因突变位点的了解，同时耐药基因突变特点也因国家和地区以及具体检测方法不同而有所差异。

1.INNO-LPA：INNO-LPA 法检测临床标本的特异度为98.4%，敏感度为69.5%；若检测痰涂片阳性标本则敏感度上升至91.7%[14]。与比例法相比，INNO-LPA法检测Mtb临床分离株RFP耐药的敏感度为95%～100%，特异度为100%。但总的来说，检测临床标本的敏感度低于临床分离株[14]。

2.GenoType法：MDTBR-LPA检测Mtb临床分离株RFP耐药与药物敏感性试验(drug sensitivity test, DST)的一致率为95.7%～100.0%[12]，检测RFP耐药的敏感度及特异度接近100%[10]；检测INH耐药与DST的一致率为86.25～89.0%[12]，检测INH耐药的敏感度为70%～90%，特异度为100%[10]。一项Meta分析表明，MDTBR-LPA检测涂阳痰标本INH耐药的敏感度为 84.3%，特异度为99.5%[6]。以DST为金标准，MTBDRplus-LPA检测Mtb临床分离株RFP耐药的敏感度为 93.1%～98.0%，特异度为34.6%～100.0%[9, 15-16]；检测Mtb临床分离株INH耐药的敏感度为86.5%～100.0%，特异度为98.1%～100.0%[9, 15-16]；检测耐多药(multidrug resistance,MDR)株的敏感度为85.7%～88.9%[15-16]，特异度均为100%[15]。对于涂阳痰标本以液体分枝杆菌培养管960培养法(liquid Mycobacterium growth indicator tube, BACTEC MGIT 960)为金标准，MTBDRplus-LPA Mtb检出一致率为66.7%～93.8%[17]；检测RFP、INH、MDR耐药的一致率分别为84.4%～100.0%[18-19]、84.7%～96.4%[18-19]和100.0%[19]。MTBDRplus-LPA检测涂阳痰标本RFP耐药的敏感度和特异度均较高，分别为96%～100%和94.4%～100.0%[2,7, 19-20]；检测INH耐药的敏感度较低(67.0%～84.9%)[2,19,21]，可能与探针未能涵盖INH 耐药相关的其他基因突变(如ahpC-oxyR和ndh)有关；也有报导敏感度达92.0%～95.3%[7]。MTBDRplus-LPA检测涂阳痰标本INH耐药的特异度为93.8%～100.0%[2,7, 18-19]；检测MDR耐药的敏感度和特异度分别为92.3%～100.0%和96.2%～100.0%[7, 18-19]。以DST为金标准，MTBDRsl-LPA检测Mtb临床分离株广泛耐药的敏感度为91.7%～100.0%，其中，卡那霉素耐药检出率为100%、氟喹诺酮类药物耐药检出率为83.9%、乙胺丁醇耐药检出率为69.4%[22-23]；检测阿米卡星耐药的敏感度为62.5%～100.0%，特异度为98.8%～100.0%[22-24]；检测氟喹诺酮类药物耐药敏感度为75.6%～100.0%，特异度为100.0%[22-23]；检测乙胺丁醇耐药敏感度为47.1%～91.7%、特异度为75%～100%[22-24]；检测丁胺卡那霉素耐药的敏感度和特异度分别为81.3%和98.7%[12]；检测氧氟沙星敏感度为94.1%～94.7%，特异度90.7%～92.6%[12, 24]。

3.AID-LPA：以DST为金标准，AID-LPA[13]检测临床痰标本INH、RFP、氟喹诺酮类、乙胺丁醇、卡那霉素或卷曲霉素、链霉素耐药的一致率分别为98.3%、100.0%、91.5%、72.9%、100.0%、98.0%；检测敏感度和特异度分别为97.8%和100.0%、100.0%和100.0%、33.3%和98.1%、60.0%和91.7%、100.0%和100.0%、100.0%和96.6%。

4.REBA-LPA：REBA-LPA[8]检测Mtb临床分离株、涂阳痰标本的敏感度和特异度分别为98.1%和100.0%、100.0%和100.0%。

三、LPA在肺外结核病诊断中的应用

WHO于2008年正式推荐使用LPA检测肺外结核标本。由于肺外结核种类繁多，标本异质性大，LPA检测结果差异也较大。

Sam等[25]用INNO-LPA法检测肺外结核标本，并以DST为标准，其一致率、敏感度、特异度分别为80.0%、61.1%、87.8%；其中，检测椎体穿刺物标本的一致率、敏感度、特异度分别为86.7%、83.3%、88.9%；检测腰大肌脓肿脓液标本分别为53.3%、50.0%、55.6%。Tortoli和Marcelli[14]以同法检测肺内外标本(痰和胸腔积液、脑脊液和尿液)，发现检测两类标本敏感度分别为77.03%、48.81%，但特异度均达98%。Alvarado-Esquivel等[26]以INNO-LPA法检测肺外标本(脑脊液、关节滑液等体液和淋巴结等组织)并与PCR比较，二者检测Mtb及其RFP耐药的一致率分别为88.2%、100.0%。Reddy 等[27]发现INNO-LPA法检测组织标本(淋巴结、脑脊液、骨关节骨组织等)的敏感度很低(10%)，究其原因，可能为标本含菌量较低，使用固定剂，目的基因扩增量少，DNA提取的过程受外界影响等。Duo等[28]用MTBDRplus法检测脑脊液标本并与PCR相比，INH、RFP、MDR耐药的检出率分别为64.29%、39.29%、32.14%。由此，建议当PCR检测为阳性时，用LPA检测其耐药性。Jadhav等[29]尝试用LPA检测脾结核标本及其耐药性，发现LPA是目前“最先进”的检测Mtb耐药的分子检测手段，适宜临床应用。Molina-Moya等[13]采用AID-LPA检测来自淋巴结、腰大肌脓液等标本，结果与DST完全一致。Gupta等[30]以BACTEC MGIT 960为标准，用MTBDR检测结核性脑膜炎患者脑脊液标本分离株，发现INH和RFP耐药的敏感度和特异度分别为93%和97%、80%和98.8%。但直接检测脑脊液标本时，Mtb检出率仅为55%。Bansal等[31]以MTBDRplus法和基因测序法首次检出眼玻璃体液Mtb阳性，检出率分别为6/11和10/11。二者检测RFP耐药性的一致率为3/3。研究发现，不同的检测方法组合及优化标本前处理过程可获得较好地结果[32]。Gu等[33]优化标本前处理后，按“综合诊断标准”[21]评价RFP耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF) 和 MTBDRplus法检测骨关节结核标本的可行性，发现二者的敏感度可达82% (41/50)和72% (36/50)，特异度均高达100%。MTBDRplus法检测RFP和INH耐药的敏感度可达83.3%和85.7%，二者特异度均高达100%，证明MTBDRplus法适宜骨关节结核的临床诊断。

四、与同类技术及其他技术的比较

1.LPA各方法间的比较：各类LPA基本原理相同，操作步骤大体相似。根据其探针设计的不同，各类LPA检出的耐药范围不尽相同，INNO-LPA法和REBA-LPA仅能检测RFP耐药；GenoType 法和AID-LPA均可检测RFP、INH，以及氟喹诺酮类药物、阿米卡星、乙胺丁醇等二线抗结核药物耐药情况，但4类方法检测Mtb及其耐药的效果相当[34]。

2.与其他技术的比较：LPA与Xpert Mtb/RIF最大不同在于LPA还可检测RFP以外药物耐药情况。二者在敏感度及特异度上难分伯仲。Rufai等[35]通过双盲、前瞻性研究发现，MTBDRplus与BACTEC MGIT 960法的一致率高达100%，而Xpert MTB/RIF法仅为64.4%。对两者检测有差异的标本行基因测序， MTBDRplus与基因测序法结果的一致率为91.3%，而Xpert MTB/RIF法仅为8.7%，故认为MTBDRplus检测性能优于Xpert MTB/RIF法。但Singh等[23]研究表明，MTBDRplus法和Xpert MTB/RIF法检测RFP耐药的敏感度和特异度均为100%和100%，且差异无统计学意义。

LPA与基因测序法均可快速、准确地发现基因突变的位置和分布。LPA受探针所限仅能检测有限突变，而基因测序法可检测所有基因突变位点，是Mtb鉴定的金标准，也是评价其他检测方法的参考方法。二者均操作繁琐、费用昂贵；但基因测序法更甚，目前多限于高级实验室使用[36]。

五、成本效益

多数人认为LPA价格昂贵，在发展中国家推广受限。Shah 等[37]发现，检测单位样本平均成本LPA为23.46美元、Xpert MTB/RIF为14.93美元、BACTEC MGIT 960法为12.16美元，LPA较后两者更昂贵。李强等[38]将耗材、劳务等其他费用以及重复检验费用等考虑在内，发现LPA的单位平均成本(31.5美元)明显低于DST(57.4美元)。Drobniewski 等[34]研究表明，LPA(MTBDRplus法)似乎是南亚地区成本效益比最合适的快速测试方法，而在其他地区为Xpert MTB/RIF法。

六、展望

LPA尤其是GenoType 法在结核病的诊断中显示了强大的优势。其对肺内Mtb及其耐药的检测性能与常规检测手段、尤其是经典的改良罗氏培养系统相比具有很良好的一致性。LPA与Xpert MTB/RIF法以及基因测序法相比也具有一定的优点；其成本效益比在一些研究中也较佳。LPA在肺外结核的诊断中的重要性也随着研究的不断深入而日益凸显。总之，LPA作为Mtb分子生物学检测技术的一个重要组成部分，极大地缩短了耐药结核的检出时间，在Mtb菌种鉴定及耐药基因检测方面发挥了巨大作用。

然而，LPA也存在一些问题。由于分子探针数目所限，某些基因区(例如ahpC、kasA、furA)的一些未知基因突变未能被检测出来[20]，因此不能检测沉默突变，可能出现假阴性结果。其需要专用PCR空间降低污染的风险[39]，且污染问题的处理比较棘手。还需要适当的基础设施及技术熟练的实验员[20,39]。再者，对基因弱突变的解释较困难。近年来，临床工作者不断探讨LPA诊断肺外结核病的可行性，并取得了一些进展。但肺外结核病尤其是骨关节结核普遍存在标本取材困难、异质性大、前处理不理想等问题[33]，导致LPA检测效力低。如何解决上述难题，以及解决LPA操作复杂、价格贵、探针有限等固有问题是未来需要研究的重要课题。

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(本文编辑：李敬文)

Progress of the molecular linear probe method in the diagnosis of tuberculosis

CHENChen*,MAYuan-zheng.

*TheGraduateDepartmentofShanximedicaluniversity,Taiyuan030001,China

MAYuan-zheng,Email:myzzxq@sina.com

The increase of drug-resistant TB cases and the hysteresis of the conventional diagnostic technique are major causes for the delayed diagnosis and poor prognosis of TB. The molecular linear probe (LPA) technology is a new PCR technique, which includes the INNO-LPA, Genotype MTBDR LPA, the Autoimmun Diagnostika TB Resistance LPA (AID-LPA), and the REBA MTB-rifa®assay (REBA-LPA). The LPA technique could diagnose tuberculosis rapidly and accurately. The common resistant genes could also be detected at the same time. Besides, the LPA technique could achieve very high sensitivity and specificity. We reviewed the research progress of LPA technique in this paper.

Tuberculosis; Molecular probes; Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.013

030001太原，山西医科大学研究生院(陈琛)；解放军第三○九医院脊柱外科(马远征)

马远征，Email：myzzxq@sina.com

2016-01-24)