荧光定量PCR技术在诊断骨关节结核患者中的价值

李元 雷国华 秦世炳



·论著·

荧光定量PCR技术在诊断骨关节结核患者中的价值

李元 雷国华 秦世炳

目的 探索荧光定量PCR技术在骨关节结核患者诊断中的价值。方法 选取2015年1月至2015年9月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科进行手术治疗的39例骨关节结核患者(病例组)和20例非骨关节结核患者(对照组)作为研究对象。收集研究对象的石蜡包埋组织标本，并对标本行结核分枝杆菌荧光定量PCR检测，计算荧光定量PCR检测的敏感度及特异度。通过病历查询研究对象的组织形态学及抗酸染色检测结果。比较荧光定量PCR技术与组织形态学及抗酸染色检测敏感度的差异。结果 病例组39例骨关节结核患者中，荧光定量PCR检测的敏感度为97.4%(38/39)；病例组中8例组织形态学不能确诊的患者中，荧光定量PCR检测出7例阳性；对照组20例非骨关节结核患者中，荧光定量PCR检测的特异度为100.0%(20/20)。病例组中，组织形态学检测的敏感度为79.5%(31/39)，抗酸染色检测的敏感度为48.7%(19/39)，均低于荧光定量PCR检测，差异有统计学意义(χ2=25.39，P=0.000)，荧光定量PCR检测敏感度高于组织形态学检测和抗酸染色检测(荧光定量PCR与组织形态学比较，χ2=4.52，P=0.033；荧光定量PCR与抗酸染色比较，χ2=23.52，P=0.000)。对照组中，组织形态学检测的特异度为100.0%(20/20)，抗酸染色检测的特异度为100.0%(20/20)，与荧光定量PCR检测的特异度比较，差异无统计学意义(χ2=0.00，P=1.000)。 结论 荧光定量PCR技术较组织形态学及抗酸染色技术具有更高的敏感度，有助于骨关节结核的诊断。

结核，骨关节； 荧光定量PCR； 诊断

骨关节结核为肺外结核，约占全部结核病患者的1%～3%[1]。结核分枝杆菌培养技术一直被认为是结核病诊断的金标准，但由于骨关节结核病灶以组织标本为主，不适宜培养；同时，骨关节结核标本培养阳性率低、耗时长[2-3]。因此，临床上骨关节结核的诊断一直以病理学检查结果为诊断依据[4]。

传统病理学诊断主要依靠组织形态学及抗酸染色，因为有不典型肉芽肿性炎及非结核分枝杆菌的存在，因此不可避免的造成漏诊或误诊[5-7]。如何提高诊断的敏感度及特异度，降低漏诊与误诊的风险就成为临床上需要解决的问题。以荧光定量PCR技术为核心的分子病理学的出现为解决这一问题提供了契机。本研究使用石蜡包埋组织标本行结核分枝杆菌荧光定量PCR检测，探索荧光定量PCR技术在诊断骨关节结核患者中的价值。

对象和方法

1.对象：选取2015年1月至2015年9月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科进行手术治疗的骨关节结核患者作为病例组，共39例。39例患者术中脓液标本经改良罗氏培养或快速培养(BACTEC 960)证实有结核分枝杆菌生长，即细菌学证实为骨关节结核患者。其中，关节结核15例，脊柱结核24例；男21例，女18例；年龄18～65岁，中位年龄为47.0岁。选取同期在本科室进行手术治疗的非骨关节结核患者作为对照组，共20例。其中，骨肿瘤8例，骨关节化脓性感染12例；男11例，女9例；年龄21～69岁，中位年龄为50.5岁。分别收集上述两组患者的石蜡包埋组织标本。通过查阅病历获得病例组和对照组患者的组织形态学结果及石蜡包埋组织标本的抗酸染色结果。本研究已通过本院伦理委员会审核，所有研究对象均签署知情同意书。

2.试剂和仪器：石蜡包埋组织DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(型号Z-RD-0060-01)购自上海之江生物科技股份有限公司；荧光定量PCR仪(型号Cobas Z 480)购自瑞士罗氏公司。

3.DNA提取：石蜡切片厚4 μm，根据组织大小取5～10片，放入1.5 ml离心管中，12 000 r/min，离心半径15 cm，离心10 min。按照试剂盒操作说明书提取DNA。

4.荧光定量PCR：按照试剂盒说明书进行。反应体系为40 μl。反应条件为：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min；93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环；于60 ℃进行荧光检测。Taqman荧光探针为6-FAM(6-羧基荧光素)标记。每批检测均设置阴性及阳性对照。检测结果判定：Ct(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)≤38为阳性；Ct=40或无扩增曲线为阴性；Ct 值介于38～40则重新检测，若重新测定Ct值依然在38～40之间，同时扩增曲线呈S形则判定为阳性，若为非典型曲线则判定为阴性。

5.统计学分析：统计学分析使用SPSS 17.0软件，以结核分枝杆菌培养结果为金标准，计算荧光定量PCR技术诊断骨关节结核患者的敏感度及特异度，三种检测方法敏感度和特异度的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.荧光定量PCR检测：病例组中，38例荧光定量PCR检测阳性，1例患者检测阴性；荧光定量PCR检测的敏感度为97.4%(38/39)。对照组中20例患者荧光定量PCR检测均为阴性，荧光定量PCR的特异度为100.0%(20/20)。

2.组织形态学检测：病例组39例患者的术后组织形态学结果：31例患者的组织形态学确诊为结核；8例患者不能确诊，包括4例患者检测结果为可疑结核，4例患者检测结果为慢性肉芽肿性炎，需要进一步鉴别诊断。组织形态学检测的敏感度为79.5%(31/39)。对照组20例患者的组织形态学检测结果均除外结核，检测的特异度为100.0%(20/20)。

3.抗酸染色结果：病例组抗酸染色结果为：19例患者抗酸染色阳性，20例患者抗酸染色阴性，抗酸染色的敏感度为48.7%(19/39)。对照组20例患者的抗酸染色结果均为阴性，抗酸染色的特异度为100.0%(20/20)。

4.三种方法检测效果的比较：三种检测方法的敏感度比较，差异有统计学意义(χ2=25.39，P=0.000)，荧光定量PCR检测敏感度高于组织形态学检测和抗酸染色检测(荧光定量PCR与组织形态学比较，χ2=4.52，P=0.033；荧光定量PCR与抗酸染色比较，χ2=23.52，P=0.000)。比较三种检测方法的特异度，差异无统计学意义(χ2=0.00，P=1.000)。

病例组中，经组织形态学检测8例患者不能确诊，应用抗酸染色法检测均为阴性；应用荧光定量PCR检测结果7例为阳性(表1)。

表1 病例组中8例组织形态学不能确诊患者的荧光定量PCR及抗酸染色结果

讨 论

目前，骨关节结核患者的诊断主要依靠病理诊断。传统病理学诊断方法主要包括组织形态学及病原学，即通过大体和镜下直接观察病灶组织的病理形态学变化，及利用抗酸染色查找病原菌来获得诊断，具有针对性强、准确性高的优点[4]。

组织形态学诊断要求病变组织具备典型的结核肉芽肿样改变(包括类上皮细胞、朗汉斯巨细胞、干酪性坏死等)才能作出诊断[4]。本研究中组织形态学技术诊断骨关节结核患者的敏感度为79.4%。但结核病变可以表现为不典型肉芽肿，同时，非结核病变也可表现为类似于结核的肉芽肿，临床上不可避免造成漏诊或误诊[5-6]。本研究发现有8例骨关节结核患者通过组织形态学不能确诊，有漏诊的风险。因此，当组织形态学诊断在遇到不典型肉芽肿性病变时无法作出诊断。

骨关节结核为感染性病变，病原菌为结核分枝杆菌，结核分枝杆菌为抗酸杆菌。若在病理标本中找到抗酸杆菌就基本可以诊断为结核病。因为抗酸染色技术简单、易行、廉价、快速，所以抗酸染色伴随结核病的诊断一直应用至今。但由于骨关节结核病灶含菌量少，加之抗酸染色技术的敏感度低，使其临床应用也受到一定限制[8-9]。本研究中抗酸染色技术诊断骨关节结核患者的敏感度为48.7%，有51.3%的患者有漏诊的风险。同时抗酸染色不能区分结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌，有误诊的风险[10]。

PCR技术自1985年问世以来得到快速发展及广泛应用，但一度曾因污染及假阳性等问题使其结果受到质疑。荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上加入荧光标记的探针，把核酸扩增、杂交及光谱检测技术结合在一起。荧光定量PCR是在一个相对封闭的系统中完成，避免了污染降低了假阳性率，同时荧光探针的使用提高了检测的敏感度及特异度[11]。

研究证实，使用石蜡包埋组织标本行结核分枝杆菌荧光定量PCR检测具有可行性及可靠性[12-13]。与罗氏培养相比，荧光定量PCR技术可以有效提高利用组织标本诊断结核病的阳性率[14-15]。本研究中，应用石蜡包埋组织标本行荧光定量PCR检测对骨关节结核患者诊断的敏感度为97.4%。当面对组织形态学及病原学都无法诊断的不典型患者时，这就需要荧光定量PCR技术来进行鉴别诊断，这是荧光定量PCR技术的优势所在。本研究显示，荧光定量PCR检测的敏感度高于组织形态学及抗酸染色技术，这说明荧光定量PCR技术可以提高结核病诊断的敏感度，降低漏诊率。同时通过检测分枝杆菌特异的基因片段，分子病理学还可以鉴别传统病理学不能鉴别的结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌[16]。以上情况说明，荧光定量PCR技术与传统组织形态学及抗酸染色技术相比具明显优势。荧光定量PCR技术在提高骨关节结核病患者诊断率的同时，明确诊断后患者就可以得到及时治疗，可以挽救患者保留更多的关节功能。

虽然荧光定量PCR技术灵敏、快速、特异，但也有假阳性的存在，因此，骨关节结核患者的诊断不能单独依赖荧光定量PCR技术，应结合传统病理学结果及临床信息[17-18]。另外，由于本研究纳入患者数较少，使结果的代表性受到限制，并可能造成检测结果特异度高。若不计成本因素，对每一份可疑骨关节结核患者的病理组织标本同时行传统病理学检测及荧光定量PCR检测，将2种检测方法并联使用则可提高敏感度，串联使用则可以提高特异度。

综上所述，本研究显示在骨关节结核患者的组织标本检测中荧光定量PCR的敏感度最高，组织形态病理学居中，抗酸染色最低。在实际临床使用中将荧光定量PCR技术与传统病理学结合使用可降低漏诊及误诊的风险。

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(本文编辑：王然 李敬文)

Evaluation the clinical value of fluorescent quantitative PCR technique in diagnosis of osteoarticular tuberculosis

LIYuan，LEIGuo-hua,QINShi-bing.

DepartmentofOrthopedics,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

QINShi-bing,Email：qinsb@sina.com

Objective To evaluate the clinical value of fluorescent quantitative PCR technique in diagnosis of osteoarticular tuberculosis. Methods During Jan 2015 to Sep 2015, 39 osteoarticular tuberculosis patients (case group) and 20 patients in other osteoarticular diseases (control group) were enrolled as research subjects from department of orthopedics, Beijing Chest Hospital, and all the patients received operation. Paraffin-embedded tissues samples were collected from all the enrolled subjects. All specimens were performed by fluorescent quantitative PCR. Sensitivity and specificity were calculated for fluorescent quantitative PCR. Histomorphology and acid fast stain results were extracted from checking records. The difference in sensitivity were compared among fluorescent quantitative PCR, histomorphology, and acid fast stain. Results Among the 39 osteoarticular tuberculosis specimens in case gruop，the sensitivity of fluorescent quantitative PCR was 97.4% (38/39), and 7 patients out of the 8 samples with negative histomorphology results were positive by fluorescent quantitative PCR test. For the control group，the specificity of fluorescent quantitative PCR was 100% (20/20). In case group, the sensitivity of histomorphology and acid fast stain was 79.5% (31/39),48.7% (19/39),respectively.As for the sensitivity, fluorescent quantitative PCR was superior to histomorphology and acid fast stain. The sensitivity in diagnosis of osteoarticular tuberculosis was statistical difference among fluorescent quantitative PCR, histomorphology and acid fast stain (χ2=25.39，P=0.000).In control group，the specificity of histomorphology and acid fast stain was all 100% (20/20).There was no statistical difference in specificity among specificity fluorescent quantitative PCR, histomorphology and acid fast stain (χ2=0.00，P=1.000). Conclusion Comparing to histomorphology and acid fast stain, fluorescent quantitative PCR has higher sensitivity. Therefore, the higher sensitivity of fluorescent quantitative PCR has the potential to improve the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.

Tuberculosis，osteoarticular； Fluorescent quantitative PCR； Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.006

101149 首都医科大学附属北京胸科医院骨科

秦世炳，Email：qinsb@sina.com

2015-10-08)