微透析技术在脑胶质瘤研究方面的应用

李彦腾 程岗 张雷鸣 张剑宁*

(1海军总医院神经外科, 北京 100048; 2解放军医学院研究生二队, 北京 100853)

·综述·

微透析技术在脑胶质瘤研究方面的应用

李彦腾1,2程岗1张雷鸣1张剑宁1*

(1海军总医院神经外科, 北京 100048;2解放军医学院研究生二队, 北京 100853)

微透析; 胶质瘤; 神经递质; 细胞因子类

脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤。由于其呈浸润性生长和手术切除后易复发等生物学特性，预后较差，病死率高，是严重威胁人类健康的疾病之一。近年来，随着科技的进步和相关研究的不断深入，患者预后有了一定程度的改善，但远未达到令人满意的水平。微透析技术，自1972年Delgado[1]发明第一根微透析探针以来，被用于多种研究领域，它是一种新型的在体连续动态采样技术，为脑胶质瘤的研究提供了一种新的手段，可以提供多项局部微环境中物质浓度的数据，对胶质瘤患者的个体化治疗有很大的指导作用。

一、基本原理和方法

微透析技术是模拟生物膜的通透作用，小分子物质在半透膜两侧可沿浓度梯度扩散的原理设计的。它是一种先进的活体采样技术，可在麻醉或清醒的生物体上，在基本不影响其正常生理生化条件下对其进行实时、动态、连续取样、分析与检测。其具有适用范围广，结果准确度高，可即时反馈等优点，因此，该技术被广泛应用于化学检测分析领域。

用于胶质瘤研究的脑部微透析系统的构成有：微透析探针、微量泵、灌流液、连接管、收集小瓶和立体定位仪等。其中，微透析探针是该系统的核心元件，半透膜管位于探针的顶部。灌流液由微量泵经入液管到达植入胶质瘤组织的探针，透过探针顶部的半透膜与组织间液进行物质交换后，经出液管流出进入收集小瓶，之后，再对流出液进行相应的定性或定量分析。衡量微透析效率的主要指标是探针的回收率，回收率与透析膜面积、灌流速度、透析时间、温度、pH值和分析物的跨膜能力有关[2～4]。另外，微透析系统在用于治疗时，一些化疗药物也可经灌流液输入肿瘤间质内，到达间质内化疗的效果。

探针植入时，需先将受测者麻醉，然后借助立体定向仪将探针插入待测的目标脑区，之后连接好微量泵和各个导管，以恒定流速注入灌流液，最后对收集液进行检测。在探针植入后的样本采集过程中，受测者可以自由活动。

二、在脑胶质瘤研究中的应用

微透析技术与高效液相色谱技术的结合，使其应用得到了广泛的推广。近年来．一些学者采用该技术测定与脑胶质瘤有关的生化指标的变化，以求对胶质瘤的发生、发展及治疗效果有进一步的认识，进而指导临床治疗。目前主要的监测指标有神经递质、细胞因子、代谢产物和局部药物浓度等。

1.神经递质：神经递质是由神经细胞合成，在突触前膜释放，特异性作用与突触后膜受体，从而实现突触间的信号传递。胶质瘤的局部占位侵袭作用、合成物质和新生血管等必然对神经信息的正常传递产生影响。脑微透析可以对细胞外液中的物质进行测定，因而可以动态监测术前术后、放化疗前后神经递质水平的变化，对脑功能受损、治疗效果等情况进行评估。检测较多的神经递质有兴奋性氨基酸、乙酰胆碱、多巴胺、五羟色胺等。Behrens等[5]证实胶质瘤细胞在其侵袭性生长时，可向间质内释放谷氨酸，谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性氨基酸，它浓度过高可导致肿瘤周围神经元的兴奋性中毒而死亡。另外，用微透析技术检测神经递质有一个明显的优势，它能动态测定受测者自由活动时递质水平的变化，使测量结果更能反映检测目的。

2.细胞因子：胶质瘤在生长、侵袭及血管形成等过程中，有多种细胞因子参与。除此之外，手术、放化疗等引起的炎症反应也会引起白细胞介素和趋化因子水平的改变。Marcus等[6]发现在胶质瘤周边组织中，多种生长因子，如转化生长因子α、内源性配体表皮生长因子、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) ，白细胞介素(interleukin, IL)，如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-1受体拮抗剂以及金属蛋白酶2、金属蛋白酶9，和金属蛋白酶抑制剂1、金属蛋白酶抑制剂2等都有统计学上显著性的变化。Jana等[7]发现在胶质瘤切除术后，周边组织中多种细胞因子，如IL-6、IL-8、IL-12p40/p70、白介素2受体、干扰素α、干扰素诱导蛋白10、单核细胞趋化蛋白1、粒细胞集落刺激因子、单核细胞炎性蛋白1α、单核细胞炎性蛋白1β水平都有显著性升高，这可能与术后的炎症反应有关，其中大部分都会随着时间下降。

3.代谢产物：肿瘤组织的代谢模式与正常脑组织有显著不同，这正是一些功能性成像，如功能磁共振成像fMRI和正电子发射计算机断层显像PET的机理。但仅仅依靠这些影像学技术来研究胶质瘤的代谢显然是不够的，脑微透析技术以其对组织损伤小而较小影响组织代谢和可持续动态监测的特点为研究胶质瘤的代谢提供了有力的工具。葡萄糖是脑组织的主要供能物质，通过有氧氧化或无氧酵解给组织供能，而乳酸是葡萄糖无氧酵解的产物，常用乳酸/葡萄糖比值来反映组织的糖代谢水平，若该值高，则组织代谢旺盛或氧供不足。Roslin等[8]用微透析技术测定了15名高级别星型细胞瘤患者，每名患者植入两枚探针，一枚在肿瘤组织内，另一枚在瘤组织周边，测定葡萄糖、乳酸、丙酮酸、谷氨酸和甘油的水平，建立了这些测量物质的基线水平。另外，他们还发现瘤组织中的乳酸水平高于周边组织，而葡萄糖水平低于周边组织，反映了胶质瘤细胞的高代谢水平，这与其他肿瘤的代谢模式相一致。腺苷是星形细胞瘤嘌呤代谢在细胞外液中的标记物。Melani等[9]用脑微透析技术结合高效液相色谱法评估了21位高级别星型细胞瘤患细胞外液中的腺苷水平，在对照组织和肿瘤组织中分别为(2.99±0.37)μM 、(1.56±0.46)μM，差别有统计学意义。

4.化疗药物：在对胶质瘤患者实施化疗时，血脑屏障的存在使肿瘤组织局部很难达到较高的药物浓度并且对肿瘤具有强效的抑制作用而不带来全身的毒副作用。间质内化疗，包括Ommaya囊、Gliadel植入片等，解决了这一困境，但患者的预后还远未达到令人满意的程度。微透析技术可以用于分析肿瘤间质内的化疗药物浓度和化疗效果，为筛选新的化疗药物和对患者进行个体化治疗有指导意义。Grossman等[10]用微透析技术研究西地尼布对U87脑胶质瘤大鼠模型脑内替莫唑胺浓度的影响, 结果显示: 替莫唑胺联合西地尼布较单用替莫唑胺，瘤内药物浓度有轻微上升，但并无统计学显著性差异(P=0.3)。Sandhya等[11]用动物模型发现在用吉西他滨进行系统化疗时，肿瘤区的药物浓度高于非肿瘤区。Lu等[12]用C6脑胶质瘤大鼠模型研究了不同结合形式的阿柔比星在肿瘤组织中的药物浓度，显示阳离子白蛋白结合聚乙二醇的载阿柔比星微粒效果较好。

5.其他：微透析技术除用于分析检测，还可作为治疗手段。增强对流输注(convection-enhanced delivery, CED)是最近广受关注的一种新型的针对颅内肿瘤的化疗方式，属于间质内化疗，药物顺浓度梯度直接扩散到靶组织，有效地提高胶质瘤局部的药物浓度，收到相对较好的治疗效果[13,14]。逆向增强对流输注(retro-convection enhanced delivery, R-CED)，是用微透析探针去除组织间液，同时通过血管途径向瘤组织内输送药物，透析液先将组织间液移除一部分，降低组织内的压力，进而使毛细血管内的液体易于渗入组织内，同时血液内的药物也跨血管进入组织内，提高药物的局部跨膜效率[15,16]。Grace等[16]发现用R-CED可增加系统化疗时瘤组织中心和肿瘤与脑组织交界区的药物浓度，提高化疗药物的有效性。单独或联合使用CED和R-ECD为间质内化疗提供了有效的工具。

三、问题与展望

微透析技术自上世纪90年代被用于中枢神经系统研究以来，随着探针植入、探针设计改良和高效液相色谱技术等的发展，在实验和临床上的应用越来越广。然而，该技术还有一些不足和在操作时需要注意的情况[17～21]：①该技术属于有创操作，对脑组织有一定的损伤，在用于临床时，应严格无菌观念，并注意局部的护理，防止发生皮肤甚至颅内感染；②需具有颅内肿瘤精确定位和高效监测分析等设备，费用较高，患者不易接受，因此，目前主要用于实验室研究，而临床应用较少；③所收集的透析液总量较少，而所含成分复杂，在用于多种分析物检测时，常遇到分离困难和标本不够的情况；④探针植入时可引起局部血流量增加、组织水肿，细胞死亡、神经胶质增生、出血等，影响检测结果；⑤随着探针植入时间的延长，回收率会有所降低；⑥测得结果受灌流液类型和灌流速度的影响，因此，需有标准统一的操作规程，以便不同实验结果之间的比较；⑦在测定药物浓度时，只能反映处于游离状态的药物分子而不包括蛋白结合型；⑧主要用于生物化学分析检测，在治疗方面的应用较少；⑨临床应用还涉及相关的伦理学问题。

微透析技术在胶质瘤研究方面是一种有力的手段，可在体实时动态监测目标组织内的神经递质、细胞因子、代谢产物和局部药物浓度等生物化学指标，进而对肿瘤的发生发展的病理生理机制有更充分的认识，评价不同治疗手段的疗效和相互作用，指导个体化治疗。随着微透析检测设备商品化的生产，它的应用会越来越广。另外，该技术在胶质瘤的治疗方面的应用也不断发展。可以预见，微透析技术的广泛应用将会给胶质瘤的研究带来巨大的进步。

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2015-03-30；

2015-06-10)

J Neurosurg. 2016 Oct 7:1-12. [Epub ahead of print]

Aggressive resection at the infiltrative margins of glioblastoma facilitated by intraoperative fluorescein guidance

NeiraJA1,UngTH1,SimsJ1,MaloneHR1,ChowDS2,SamanamudJL1,ZanazziGJ3,GuoX4,BowdenSG1,ZhaoB4,ShethSA1,McKhannGM2nd1,SistiMB1,CanollP3,D'AmicoRS1,BruceJN1

1DepartmentofNeurologicalSurgery;2DepartmentofNeuroradiology;3DepartmentofPathologyandCellBiology;4DepartmentofRadiology,ColumbiaUniversityMedicalCenter,NewYork,NewYork.

ObjectiveExtent of resection is an important prognostic factor in patients undergoing surgery for glioblastoma (GBM). Recent evidence suggests that intravenously administered fluorescein sodium associates with tumor tissue, facilitating safe maximal resection of GBM. In this study, the authors evaluate the safety and utility of intraoperative fluorescein guidance for the prediction of histopathological alteration both in the contrast-enhancing (CE) regions, where this relationship has been established, and into the non-CE (NCE), diffusely infiltrated margins.MethodsThirty-two patients

fluorescein sodium (3 mg/kg) intravenously prior to resection. Fluorescence was intraoperatively visualized using a Zeiss Pentero surgical microscope equipped with a YELLOW 560 filter. Stereotactically localized biopsy specimens were acquired from CE and NCE regions based on preoperative MRI in conjunction with neuronavigation. The fluorescence intensity of these specimens was subjectively classified in real time with subsequent quantitative image analysis, histopathological evaluation of localized biopsy specimens, and radiological volumetric assessment of the extent of resection.ResultsBright fluorescence was observed in all GBMs and localized to the CE regions and portions of the NCE margins of the tumors, thus serving as a visual guide during resection. Gross-total resection (GTR) was achieved in 84% of the patients with an average resected volume of 95%, and this rate was higher among patients for whom GTR was the surgical goal (GTR achieved in 93.1% of patients, average resected volume of 99.7%). Intraoperative fluorescein staining correlated with histopathological alteration in both CE and NCE regions, with positive predictive values by subjective fluorescence evaluation greater than 96% in NCE regions.ConclusionsIntraoperative administration of fluorescein provides an easily visualized marker for glioma pathology in both CE and NCE regions of GBM. These findings support the use of fluorescein as a microsurgical adjunct for guiding GBM resection to facilitate safe maximal removal.

1671-2897(2016)15-463-03

李彦腾，硕士研究生，E-mail：yantenglibj@sina.com

*通讯作者：张剑宁，教授、主任医师，博士生导师，E-mail：jnzhang2005@163.com

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