急性肾损伤新的诊断生物标志物研究进展

王海莹 涂晓文 ★

急性肾损伤新的诊断生物标志物研究进展

王海莹 涂晓文 ★

急性肾损伤（AKI）是由各种原因引起的肾功能在短时间（几小时至数天）内突然下降，导致含氮和非含氮代谢物蓄积而引起的一种临床综合征。如能早期发现，及早纠正引起ARF的因素，肾损伤是可以完全逆转。晚期AKI即使经过积极的治疗，肾功能也不能完全恢复，而发展成慢性肾脏疾病，最终依赖肾脏替代疗法（RRT）。早期生物标志物的缺乏是目前AKI治疗预防策略的障碍，因此，寻找新的早于Scr的诊断生物标志物，用以早期发现，早期医疗干预，是目前AKI治疗的关键。

1　 新的诊断生物学标志物

1.1 中性粒相关脂质运载蛋白（NGAL） NGAL也称LCN2，最初是Kjeldsen等［1］在人类中性粒细胞中发现的一种分子量为25-KDa分泌性蛋白。在人体大多数正常组织，包括肾、肺、胃、结肠低水平表达，主要参与细胞内炎症反应、铁离子转运和肿瘤细胞转移等功能［2］。肾功能受损时，NGAL在肾小管上皮细胞被大量诱导表达，尿液和血清中较易检测。应用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）及逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）分析，NGAL主要由损伤的肾小管上皮细胞表达，在肾损伤2h就可检测到升高的NGAL［3］。Nickolas等［4］在急诊室收集635例分别患有肾前性氮质血症、慢性肾疾病者或肾功能正常者、AKI患者进行前瞻性研究，单一次12h测量尿液NGAL水平，结果表明诊断AKI的敏感性90%，特异性99%。Adis［5］的研究显示，尿液NGAL水平AKI组与非AKI组比较差异有统计学意义（P＜0.05），AKI-1期组术后6h NGAL最高值117ng/ml，敏感性94%，特异性78%，ROC曲线下面积为0.84。AKI-2期组，敏感性100%，特异性87%，ROC曲线下面积为0.9，术后6hNGAL含量为264ng/ml。NGAL不仅能够早期监测AKI的发生，还能够评估AKI损伤的严重程度。NGAL无论是敏感性还是特异性明显优于Scr，同时具有易于监测无创等优点，国内学者普遍认为其可以作为AKI早期的独立预测指标。

1.2 肾损伤分子-1（KIM-1） KIM-1是1型跨膜蛋白，在正常肾脏组织中低水平表达，在缺血及肾毒性损伤后，近曲小管上皮细胞特异性诱导表达，参与肾小管的损伤及修复，并释放到尿液中稳定存在［6］。采用酶联免疫吸附法（ELISA）可定量尿液KIM-1水平，进而作为透析指征以及评估病死率［7］。Vaidya等［8］在大鼠肾缺血/再灌注损伤模型证实，KIM-I较Scr能更好的预测AKI。Han等［9］对113例接受心肺转流术患儿的前瞻性研究中，术后3d AKI的发生率31%，尿液KIM-1术后2h即开始增高，且2～12h持续稳定升高，12h 诊断AUC为0.83，增加了术后3d对AKI的预测。尿KIM-1在AKI早期诊断中具有无创、迅速、灵敏、特异和准确等优点，近年来对快速尿液试纸测试KIM-1的研究，KIM-1临床价值日益突出［10］。在一项meta分析中，11个入选的研究共有2979例患者，五个前瞻性研究，两个横断面研究和四个病例对照研究。结果表明尿KIM-1诊断AKI敏感性为74.0%（95%置信区间，61.0%～84.0%），特异性为86.0%（95%置信区间，74%～93%）。SROC分析显示的曲线下面积为0.86（0.83～0.89）。亚组分析表明，人口设置和检测时间是影响KIM-1 AKI诊断效率的关键因素［11］。

2　 小结

急性肾损伤，一直是临床上关注的热点，已经成为肾脏病研究的主要内容。2012年3月，改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）发表急性肾损伤指南，对AKI的定义、分期制定了新的诊断标准。但新的诊断标准仍然以尿量和血肌酐作为诊断依据，对AKI的诊断标准并不可靠，同时在诊断上严重滞后。近年来不断有新的诊断生物标志物被证实，但是其临床价值还有待大规模试验进行分析考证。生物AKI目前无有效治疗措施，终身肾脏替代治疗严重影响患者生活质量。寻找新的敏感性强、无特异性高生物诊断标志物早期干预，已经成为治疗AKI的重要途径，已被美国肾脏病学会、急性肾损伤网，国家健康总局定为优先研究领域。

3　 展望

早期AKI生物标志物的研究，是目前AKI治疗及其预防关键因素。早期AKI生物标志物的研究尽管进行了大量动物模型及其临床分析，但是由于受AKI类型、受试对象、病例数量以及标志物检测时间的影响，诊断标志物还需要更大规模的研究和统计分析。同时作者认为单独依靠某一检测指标诊断，其特异性、灵敏度较难保证。近年来已有不少学者采用联合检测生物标志物进行AKI诊断，在Zhou等［25］的一项研究中，利用尿液KIM-1、NGAL、IL-18联合检测大鼠缺血再灌注AKI，结果较单一检测指标特异性显著升高。但由于受检测时间的限制，作为AKI诊断标准仍有缺陷。micro RNA具有稳定、不受检测时间限制，IGFBP7、TIMP-2具有易于检测，敏感性特异性高等优点，可以从基因水平联合蛋白水平对AKI进行早期诊断，有望成为各种病因AKI早期诊断有价值的潜在生物标志物。

1 Kjeldsen L，Johnsen AH，SengeltlSv H，et al.Isolation and primary structure of NGAL.a novel protein associated with human neutrophil gelatinase.J Biol Chem，1993，268：10425～10432.

2 Mishra J， Ma Q， Prada A， et al. Identification of neutrophil gelatinaseassociated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury. J Am Soc Nephrol 2003， 14（10）：2534～2543.

3 FeldkamT，Bienbolz A，Kribben A.Urinary neurtrophil gelatinaseassociated lipocalin（NGAL）for the detection of acute kidney injury after orthotopic liver transplantation.NephrolDialTransplant，2011， 26（5）：1456～1458.

4 Nickolas TL，O'Rourke MJ，Yang J，et al.Sensetivity and specificity of a single emergency department measurement of Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin for diagnosing acute kidney injury .Ann Intem Med，2008，148（11）：810～819.

5 Adis Tasanarong，Pisit Hutayanon， Dilok Piyayotai .Urinary Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin predicts the severity of contrast-induced acute kidney injury in chronic kidney disease patients undergoing elective coronary procedures.BMC Nephrology 2013， 14：270.

6 Ichimura T， Bonventre JC， Bailly V， et al. Kidney injury molecule-1（KIM-1）， a putative epithelial cell adhesion molecule containing a novel immunoglobulin domain， is up-regulated in renal cells after injury. J Biol Chem 1998； 273：4135～4142.

7 Gong Li，Yu Hua，Zhu Ge Yifeng，et al. Protective effect of NGAL on renal tubular epithelial cell apoptosis in rat renal ischemia reperfusion injury.Journal of Clinical Nephrology，2012，12（2）：85～88.

8 Vaidya VS，Ramirez V，Ichimura T，et al.Urinary kidney injury molecule-1：a sensitive quantitative biomarker for early detection of kidney tubular injury.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290：517～529.

9 Han WK， Wagener G， Zhu Y， et al. Urinary biomarkers in the early detection of acute kidney injury after cardiac surgery. Clin J Am Soc Nephrol， 2009，4： 873～882.

10 Huang Y， Don-Wauchope AC . The clinical utility of kidney injury molecule 1 in the prediction， diagnosis and prognosis of acute kidney injury： a systematic review. Inflamm Allergy Drug Targets ，2011，10：260～271.

11 Shao X， Tian L， Xu W， et al. Diagnostic Value of Urinary Kidney Injury Molecule 1 for Acute Kidney Injury： A Meta-Analysis.2014.

12 Wei Q，Bhatt K，He HZ，et al. Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol，2010，21（5）： 756～761.

13 Roel Bijkerk，Coen van Solingen， Hetty C. de Boer，et al.Hematopoietic MicroRNA-126 Protects against Renal Ischemia/Reperfusion Injury by Promoting Vascular Integrity.American Society of Nephrology，2014.

14 Melissa A Bellinger1， James S Bean1.Concordant Changes of Plasma and Kidney MicroRNA in the Early Stages of Acute Kidney Injury： Time Course in a Mouse Model of Bilateral Renal Ischemia-Reperfusion，2014，4（9）：e93291.

15 Krithika Ramachandran， Janani Saikumar， Vanesa Bijol， et al.Human miRNome Profiling Identifies MicroRNAs Differentially Present in the Urine after Kidney Injury.American Association for Clinical Chemistry，2013，59：12.

16 Yang QH， Liu DW， Long Y， et al. Acute renal failure during sepsis：potential role of cell cycle regulation. J Infect，2009，58： 459～464.

17 Devarajan P .Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury. J Am Soc Nephrol ，2006，17： 1503～1520.

18 Rodier F， Campisi J， Bhaumik D.Two faces of p53： aging and tumor suppression. Nucleic Acids Res，2007，35： 7475～7484.

19 Kashani K， Al-Khafaji A， Ardiles T，et al. Discovery and validation of cell cycle arrest biomarkers in human acute kidney injury. Crit Care ，2013，17： R25.

20 Kashani K， Al-Khafaji A， Ardiles T， et al. Discovery and validation of cell cycle arrest biomarkers in human acute kidney injury. Crit Care，2013，17： R25.

21 Han WK， Wagener G， Zhu Y， et al. Urinary biomarkers in the early detection of acute kidney injury after cardiac surgery. Clin J Am Soc Nephrol，2009，4： 873～882.

22 Parikh CR， Abraham E， Ancukiewicz M，et al. Urine IL-18 is an early diagnostic marker for acute kidney injury and predicts mortality in the intensive care unit. J Am Soc Nephrol 2005； 16： 3046～3052.

23 Lachmann RA， Werchan S， Schachtrup C， et al. Liver-type fatty acid binding protein in serum and bronchoalveolar lavage in a model of acute respiratory failure because of surfactant depletion-a possible marker for lung damage？ Clin Physiol Funct Imaging，2006， 26： 371～375.

24 钟白云，王堃，廖经忠，等.血清胱抑素C与危重病人急性肾损伤.中国现代医学杂志，2009，19（11）： 1705 ～1709.

25 周芳芳，罗群，兰凯.尿液KIM-1、NGAL、IL-18联合检测在大鼠缺血再灌注急性肾损伤早期诊断中的意义.浙江医学，2010，（8）：1202～1204.

100088 北京 中国人民解放军第二炮兵总医院
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1.3 小分子核糖核酸（micro RNA） 随着大通量miRNAs 芯片和高灵敏实时荧光定量PCR 等实验手段的应用，不少学者从基因组学的层面上研究AKI，为AKI早期诊断、干预治疗提供新的策略。在近端肾小管条件性Dicer 敲除的小鼠模型证实MicroRNAs 在维持肾脏正常生理功能必不可少［12］。大量研究证明miRNAs的表达异常影响肾脏细胞的增殖与凋亡，与AKI的发生和发展有关。在一项缺血/再灌注急性肾损伤大鼠动物模型中，microRNA-126过度表达，与肾小球毛细血管网增生有关［13］。microRNA-126有促进血管再生以及调节造血干细胞/祖细胞增殖分化的作用。Melissa A［14］建立动物模型用以研究AKI早期损伤microRNAs的表达异常情况，病例组双侧肾动脉夹闭27min，对照组采用假手术，分别检测AKI后血浆3h、6h、24h miR-714、miR-1188、miR-1897-3p、miR-877、miR-1224。结果miR-1897-3p表达显著差异，由此可以推测该基因可能是肾脏损伤的靶基因。在Krithika等［15］对照研究中，病例组AKI组选取98例（71例来自ICU住院患者，27例来自肾移植术后急性肾小管坏死）对照组非AKI组97例（74例健康志愿者，23例ICU住院患者）。利用实时荧光定量PCR 检测尿液MicroRNAs，结果尿4种MicroRNAs显著差异。microRNA-21（P=0.0005），microRNA-200c（P＜0.0001），microRNA-423（P=0.001），microRNA-4640（P=0.0355）。4种microRNA是联合检测ROC曲线下面积0.91，明显提高单独micro-RNA预测AKI准确性。尿液中micro-RNAs大约有1808种，尽管大量的研究证实在ALI损伤时，部分micro-RNAs表达增高，但是具体的RNA种类在各种类型AKI中，并不一致。同时目前对micro-RNA表达异常对AKI干预以及预后价值无相关研究。尽管如此，细胞外的小分子核糖核酸（RNA）具有稳定、不受检测时间限制，敏感性以及特异性较高等优点，已被用于其他各种疾病诊断的生物标记物，为AKI的诊断奠定基础。

1.4 胰岛素样生长因子-7（IGFBP7）、金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2） AKI病理生理过程非常复杂，肾小管间质炎症、血管内皮细胞和上皮细胞等不同细胞增殖分化均有影响。涉及机制包括免疫，炎症，细胞凋亡和细胞周期通路。IGFBP7、TIMP-2是典型的肿瘤抑制生长因子，参与细胞周期的调节［16］。国外最近的一项研究表明，在缺血或脓毒症导致AKI时，肾小管上皮细胞停留在细胞周期G1期，此时IGFBP7、TIMP-2参与细胞损伤早期［17］，其作用机制可能是通过防止受损的细胞DNA分裂，且这种作用能够持续直至DNA损伤修复［18］。用western blot通过尿液检测升高的IGFBP7、TIMP-2［19］。在Sapphire［20］的一项体外循环心脏手术后AKI研究中，选取50例术后高危AKI患者，26例发生AKI，连续检测不同时间点尿液IGFBP7、TIMP-2水平，术后4h AKI患者从最初的0.49升高到1.51。AKI组术后12h单独应用IGFBP7预测，其AUC为0.76，单独TIMP-2预测，其AUC为0.79。IGFBP7、TIMP-2联合预测AUC为0.81。术后24h两者联合检测AUC为0.84，敏感性0.92，特异性0.81。该实验重要价值还在于对经过治疗AKI患者出院时，进行再次测定，IGFBP7、TIMP-2降到基线水平以下。IGFBP7、TIMP-2不仅具有敏感性，特异性高等优点，同时预测肾功能预后有重要价值。心脏术后AKI早期生物标志物的研究是最近十年来的重要目标，一些新的标志物包括NGAL、KIM-1也被提出，但是这些生物标志物在预测心脏手术后AKI敏感性、特异性相当低，ROC曲线分别为0.65 KIM-1［21］，0.67 NGAL［21］。IGFBP7、TIMP-2在预测心脏术后AKI显示出较大优势，但是对于其他类型AKI的预测还有待进一步研究。

另外，近年来国内外对AKI早期生物标志物的研究较多的还有白介素-18、肝型脂肪脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、胱抑素-C（cys-c）等，白介素-18是在近端小管上皮细胞产生的一种促炎性细胞因子，在急性肾损伤时其水平明显升高，但白介素-18水平较易受到其他因素影响［22］。L-FABP是脂质代谢关键蛋白，参与肾小管上皮细胞损伤的应激反应，其水平受脂肪代谢的影响［23］。Cys-c是r球蛋白分解后的一种尿蛋白片段，正常生理状态下可被近端肾小管完全吸收，可通过测定Cys-c诊断AKI损伤程度，但由于其受尿蛋白的影响，近年来不被用作诊断AKI［24］。