不同海拔及时间下大鼠白细胞TERT及HIF-1α mRNA的表达及其对机体细胞寿命的影响和可能机制※

王亚平，格日力

(1.青海省人民医院消化科；2.青海大学医学院高原医学研究中心)



不同海拔及时间下大鼠白细胞TERT及HIF-1α mRNA的表达及其对机体细胞寿命的影响和可能机制※

王亚平1，2，格日力2

(1.青海省人民医院消化科；2.青海大学医学院高原医学研究中心)

摘要目的研究不同海拔及时间下大鼠白细胞TERT及HIF-1α mRNA的表达规律，并探讨其对机体细胞寿命的影响及其可能机制。方法110只大鼠随机分为低海拔对照组、中度海拔组及特高海拔组，后两组根据时间不同分为1、3、7、15、30天组，每组各10只。采用real-time PCR法检测大鼠白细胞端粒酶逆转录酶(TERT)及低氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA表达水平，并行相关意义分析。结果中度海拔组大鼠白细胞TERT mRNA水平明显高于低海拔与特高海拔组(P<0.05)，各组TERT mRNA水平变化与时间相关；HIF-1α mRNA在中度海拔与特高海拔组表达均升高，中度海拔组又高于特高海拔组(P<0.05)，其变化趋势与TERT水平的变化基本一致。结论轻度低氧可通过HIF-1α上调TERT的表达，从而使白细胞端粒酶活性升高、端粒长度延长、机体细胞寿命增加。

关键词海拔时间端粒酶逆转录酶低氧诱导因子1α

EXPRESSIONS OF TERT AND HIF-1α mRNA IN RAT

LEUKOCYTES UNDER DIFFERENT ALTITUDES AND

DIFFERENT PERIODS OF TIME AS WELL AS THE INFLUENCE

AND POSSIBLE MECHANISM ON THE LIFE SPAN OF CELLS

Wang Yaping1，2，Ge Rili2

(1.Digestive Department of Qinghai Provincial People′s Hospital，Xining，810007；

2.Research Center for High Altitude Medical Sciences，Medical College of Qinghai University，Xining，810001)

Abstract ObjectiveTo investigates the changes of TERT and HIF-1α mRNA in rat leukocytes under different altitudes and different periods of time，discusses the influence and possible mechanism on the life span of body cells.Methods 110 rats were randomly divided into three groups，low altitude group，moderate altitude group and very high altitude group.The later two groups were further divided into 1，3，7，15 and 30 days groups，with 10 rats in each group.TERT and HIF-1α mRNA levels of leukocytes were measured using real-time PCR，and analyzed the related significance.Results The TERT mRNA expression of leukocytes in moderate altitude group was significantly higher than control group and very high altitude group(P<0.05)，and the changes of TERT mRNA expression are associated with time.The HIF-1α mRNA expression in moderate altitude group and very high altitude group were higher than that of control group(P<0.05)，however，the HIF-1α expression was much higher in the moderate altitude group than in the very high altitude group.HIF-1α mRNA expression changed in a similar manner as the TERT mRNA.Conclusions The TERT expression was up-regulated following the induction of HIF-1α during exposure to mild hypoxia，it makes the increasing of activity for leukocytes telomerase and the elongatin of telomere length，the life span on cells was extended.

KeywordsAltitudesTimeTelomerase reverse transcriptaseHypoxia-inducible factor 1α

高原环境有诸多不利因素作用于人体，其中低氧是影响和损伤机体的关键。目前关于低氧对细胞端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、端粒酶(telomerase)及端粒(telomere)影响的研究报道逐渐增多，但其主要集中在对离体干细胞及肿瘤细胞的短期研究，缺乏不同低氧水平及时间下在体体细胞的系统观察比较[1-3]。因此本研究从整体水平上观察不同海拔及不同时间下大鼠白细胞TERT及低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)mRNA的表达水平及变化规律，并探讨其对机体细胞寿命的影响及其可能机制。

1材料与方法

1.1动物处理

110只健康雄性Wistar 大鼠[(180±20)g，购自中国药科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(苏)2009-009]随机分为 3 组：低海拔对照组 10只(LA，南京，10m)，中度海拔组50只(MA，西宁，2260m)，特高海拔组 50只(VHA，低压氧舱模拟，5000m)，后两组根据暴露时间不同分为1、3、7、15、30天组，每组各10只。三组除所处海拔高度不同外，其居住及饮食环境基本一致，所有大鼠均自由进食(水)。按不同海拔不同时间点分别抽取各组大鼠静脉血(5mL)，其中低海拔组在南京即刻取血，中度海拔组在西宁按不同时间点取血，特高海拔组大鼠在低压氧舱(模拟海拔 5000m)按不同时间点取血。

1.2仪器和试剂选择

低压氧舱室(贵州风雷航空机械有限公司，型号：DYC-3000，体积：8m×3m×3m)，全自动血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司)，ABI7500荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司)，TRIzol RNA提取试剂盒(Invitrogen公司)，Script RT Kit(北京天根生物制剂有限公司)，2×SYBR Premix Ex Taq(美国ABI公司)。

1.3引物设计

引物终浓度及序列：目的基因，TERT rat-f(400nmol)：5′-GAC ATG GAG AAC AAG CTG TTT GC-3′，TERT rat-r(400 nmol)：5′-ACA GGG AAG TTC ACC ACT GTC-3′；HIF-1a rat-f(400nmol)：5′-CTA TGA CGT GCT TGG TGC TGA T-3′，HIF-1a rat-r(400nmol)：5′-CTG TAC TGT CCT GTG GTG ACT T-3′。内参基因：18S rat-f(400nmol)：5′-AGT GAT CCC CGA GAA GTT T-3′，18S rat-r(400nmol)：5′-GCT TTC CTC AAC ACC ACA T-3′。

1.4静脉血红蛋白(HGB)测定

使用全自动血细胞分析仪测定静脉血HGB，采集并分析数据。

1.5RNA的提取及鉴定

使用TRIzol RNA提取试剂盒提取大鼠静脉血白细胞基因组总RNA，测定其浓度及质量，取2 μg A260/A280为1.9-2.0的总RNA为逆转录模板，逆转录合成第一链cDNA，用于real-time PCR实验。

1.6TERT及HIF-1α mRNA测定

采用real-time PCR法测定大鼠白细胞TERT及HIF-1α mRNA水平：制作标准曲线，以样品cDNA原浓度为起始浓度依次稀释，稀释因子为 2，共稀释5个浓度；根据标准曲线优化反应体系，使目的基因和内参基因的扩增效率一致；PCR 反应体系(20μL体系)为：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，第一链cDNA 1 μL，目的基因TERT、HIF-1α及内参基因 18S rRNA上、下游引物各 1 μL，用灭菌双蒸水补齐至 20 μL。实验在 ABI7500 荧光实时定量 PCR 仪中进行，每个样品设3个重复孔，每组样品重复1 次。目的基因与内参基因的 PCR 反应条件一致，50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算TERT及HIF-1α mRNA的表达水平，即ΔCt = CtTERT/HIF-1α- Ct18S；2-ΔΔCt=2-(ΔCt1-ΔCt2)，其中ΔCtl与ΔCt2分别为实验组与对照组样本的ΔCt值。

1.7统计学处理

2结果

2.1各组大鼠静脉HGB水平比较(表1)

Table 1±s)

注：*与LA组比较P<0.05；☆与VHA3组比较P<0.05；▲与VHA7组比较P<0.05；★与VHA15比较P<0.05；#与MA3组比较P<0.05；△与VHA3组比较P<0.05。□与MA组同时间段比较P<0.05.

表1显示，特高海拔组大鼠静脉HGB随时间的延长而逐渐升高，其明显高于低海拔组与中度海拔组(P<0.05)，说明通过模拟低压氧舱成功建造了特高海拔组大鼠模型。

2.2各组大鼠白细胞TERT mRNA水平比较(表1)

表1显示，中度海拔组大鼠白细胞TERT mRNA表达水平明显高于低海拔组与特高海拔组(P<0.05)。TERT mRNA水平的变化与时间相关，中度海拔组在第1天明显升高，随后下降并保持稳定，但仍高于其他两组水平，特高海拔组在第1天出现短暂升高，随后降为与低海拔组一致的水平并保持稳定。

2.3各组大鼠白细胞HIF-1α mRNA水平比较(表1)

表1显示，HIF-1α mRNA表达水平在中度海拔与特高海拔组均明显升高(P<0.05)，中度海拔组又高于特高海拔组(P<0.05)，各组白细胞HIF-1α mRNA表达水平的变化趋势与TERT mRNA表达水平的变化基本一致。

3讨论

已知在正常细胞中表达TERT能够重建端粒酶活性，延长染色体末端的端粒长度，促进细胞生长，增加细胞寿命[4]。已有的研究也表明TERT可维持端粒长度，阻止凋亡发生，从而使细胞保持年轻状态及永生化[5]，而抑制TERT可使细胞丧失端粒酶活性，发生衰老凋亡[6]。HIF-1α在低氧诱导的相关基因表达中起关键作用，低氧环境下HIF-1α表达增高可激活其下游靶基因转录表达，从而调动机体的低氧适应机制，使机体耐受低氧[7-8]。研究发现，体细胞在正常情况下维持较低水平的端粒酶活性，当进入低氧环境时，HIF-1α表达增高可上调 TERT 的表达，从而增强端粒酶活性、延长端粒长度[9]。本研究显示中度海拔组大鼠白细胞 HIF-1α及TERT mRNA的表达明显升高，提示轻度低氧可诱导HIF-1α上调TERT表达。

氧化应激是损伤细胞端粒和抑制端粒酶活性的主要原因之一。当暴露于严重低氧环境时，机体可产生大量的活性氧自由基(ROS)，ROS通过间接下调TERT的表达及端粒酶活性，使端粒缩短加快[10-11]。本研究显示特高海拔组大鼠白细胞HIF-1α mRNA的表达水平尽管高于低海拔对照组，但却低于中度海拔组，其主要是由于严重低氧环境下机体产生的大量ROS可部分抑制HIF-1α的高表达，使一些对细胞低氧敏感基因的适应性反应遭到损害[12]，细胞TERT表达随之下降，叠加ROS即氧化应激对TERT表达及端粒酶活性的直接抑制作用，抵消了低氧状态下HIF-1α对TERT、端粒酶活性的上调作用，最终使特高海拔组大鼠白细胞TERT表达无明显变化。同时暴露于低氧环境后，HIF-1α、TERT的表达呈现一定的变化趋势，即第一天明显升高，随后下降并保持稳定。研究发现[13-14]，急性低氧可诱导机体HIF-1α高表达，而慢性低氧可下调HIF-1α的基因及蛋白表达，从而使TERT随之发生相应的表达变化。

本研究结果表明，轻度低氧通过HIF-1α上调TERT的表达，可使白细胞端粒酶活性升高，端粒长度延长，机体细胞寿命增加。本研究系统地观察了不同低氧水平和低氧时间下大鼠白细胞TERT及HIF-1α mRNA的表达情况，发现在低氧环境下，TERT 的表达是随HIF-1α的表达水平而变化的，二者的变化趋势基本一致，且其表达水平变化与低氧暴露时间密切相关。但这一发现仍存在一些不足及局限性：一是本研究只是对大鼠的研究分析，与人体之间存在一定的差异；二是本研究为短期研究，缺乏长期的观察比较，故由大鼠所得出的结论并不一定能代表不同低氧水平及时间对人体白细胞TERT、端粒酶活性及端粒长度的影响。针对以上不足及局限性，下一步的主要研究方向：首先对合适的人群进行相关指标的分析研究，其次分别从短期和长期两个方面进行观察比较，进一步深入研究低氧对人体细胞TERT、端粒酶、端粒及其寿命的影响。

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收稿日期2015-02-03

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.001

中图分类号R363.16

文献标识码A

※：国家自然科学基金(31160219)；国家重点基础研究发展规划项目(973)(2012CB518200)；国家国际合作项目(2011DFA32720)

王亚平(1982~)，女，汉族，甘肃籍，博士，主治医师