MMP-9、TIMP-1在放射性肺损伤小鼠中的表达

瞿述根，陈　凡，张玉霞，姚雪琼，王　财，冯瑞兴，王昆龄

(1.青海大学医学院，西宁 810001；2.青海大学附属医院，西宁 810001)



MMP-9、TIMP-1在放射性肺损伤小鼠中的表达

瞿述根1，陈凡2△，张玉霞1，姚雪琼1，王财2，冯瑞兴2，王昆龄2

(1.青海大学医学院，西宁 810001；2.青海大学附属医院，西宁 810001)

摘要目的探讨MMP-9、TIMP-1在还原性谷胱甘肽防治高原放射性肺损伤小鼠的表达。方法100只BALB/c小鼠随机分为5组，预防性予GSH，在医用直线加速器下建立RILI实验动物模型，不同时间获取标本。ELISA检测MMP-9、TIMP-1表达，HE染色观察病理变化。结果15 Gy剂量照射下，使用GSH后MMP-9表达上调，较单纯照射组下降(P<0.05)，而30 Gy下，MMP-9表达上调且较15 Gy+GSH组低。TIMP-1表达较单纯照射组升高，30 Gy剂量下GSH防治作用弱(P<0.05)。结论GSH具有对RILI的防护作用，可促进损伤恢复。

关键词放射性肺损伤 还原性谷胱甘肽 MMP-9 TIMP-1

THE EXPRESSION OF MMP-9、TIMP-1 IN MICE WITH

RADIATION-INDUCED LUNG INJURY

Qu Shugen1，Chen Fan2，Zhang Yuxia1，Yao Xueqiong1，Wang Cai2，Feng Ruixing2，Wang Kunling2

(1.Qinghai University Medical College；2.Qinghai University Affiliated Hospital，Qinghai Xining 810001，China)

Abstract ObjectiveTo discuss the expression of MMP-9、TIMP-1 by the prevention and control of GSH in mice with radiation-induced lung injury in plateau.Methods 100 BALB/c mice were randomly divided into 5 groups.RILI experimental animal model was set up under the medical linear accelerator with GSH.The expression of MMP-9 and TIMP-1 was detected by ELISA，and HE staining was used to watch pathological change.Results The expression of MMP-9 raised after use of GSH，and decreased relatively simple exposure group with 15 Gy(P<0.05)，but it was lower in 30 Gy than 15 Gy+GSH.The expression of TIMP-1 raised comparing to simple exposure group，and it was low of prevention and cure function in 30 Gy(P<0.05).Conclusion It had preventtion on RILI of GSH，and promoted injury recovery.

KeywordsRadiation-inducedLung injuryGSHMMP-9TIMP-1

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)-9参与了细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)损伤与重建，引起细胞壁破坏和维持ECM代谢平衡[1]。近年来发现MMP-9和基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1在放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury，RILI)中的研究有着重要的作用。在肺癌等胸部其他肿瘤放射治疗过程中，正常肺组织受到超过其耐受剂量致RILI发生无法避免，而目前针对RILI的治疗方案有限[2]。有文献显示，还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)对RILI存在某种影响。本课题拟通过RILI实验动物模型开展相关实验研究。

1材料与方法

1.1实验动物

选取7~8周SPF级体重(20±2)g BALB/c小鼠100只〔动物合格证号：SCXK(京)2014-0005〕，随机分为空白组(20只)、15 Gy组(20只)、30 Gy组(20只)、15 Gy+GSH组(20只)、30 Gy+GSH组(20只)，每组根据不同时间点再分成4小组，每组5只，饲养于青海大学医学院实验动物中心。

1.2试剂

注射用还原性谷胱甘肽钠由昆明积大制药股份有限公司提供，0.5%的戊巴比妥钠由青海大学医学院高原医学研究中心低氧生理研究室提供，0.9%氯化钠注射液由四川科伦药业股份有限公司提供。小鼠MMP-9和TIMP-1 ELISA试剂盒由北京诚林生物科技有限公司提供。苏木精、伊红由南京奥多福尼生物科技有限公司提供，10%中性甲醛由南京化学试剂有限公司提供，乙醇、丙酮、二甲苯(分析纯)均由天津津东天正精细化学试剂厂提供。

1.3主要仪器

23EX医用直线加速器由美国WARIAN公司提供，分析用电子天平由上海方瑞公司提供，KA-1000型台式离心机由上海安亭科学仪器公司提供，DW-HL328超低温冰箱由中科美菱公司提供，酶标仪由北京朗普科技公司提供，XE-2100全自动血液分析仪由日本东亚希森美康公司提供，组织切片机由德国LEITZ公司提供，电热恒温培养箱由上海国光医化仪器公司提供，光学显微镜由日本OLYMPUS公司提供。

1.4实验方法

1.4.1建模

每只小鼠在照射5 min前称重后腹腔注射0.5%戊巴比妥钠0.2 mL进行麻醉，GSH干预组于麻醉后2 min腹腔注射240 mg/mL的GSH 0.2 mL，未干预组进行同样操作，腹腔注射等体积生理盐水作对照。小鼠麻醉后用夹子固定四肢，放于医用直线加速器治疗床上，胸部激光定位，设置1×2 cm2照射野，源皮距98 cm，剂量率3 Gy/min，照射后放回原饲养地，并记录小鼠照射后一般情况。

1.4.2小鼠活动度测量

每笼放入半径5 cm纸片3张、放置照射后小鼠5只，正常饲养24 h，随后取出纸片，测量残余纸片的面积，换算出每只小鼠24小时内咬去纸片的面积，以此作为小鼠活动度大小的标志，计算小鼠照射后1 w内活动度。

1.4.3取材

于照射前、后1、2、3 w对小鼠眼球采血取样，收集40 μL于肝素钠抗凝管中，其余收集于冻存管中。采用颈部脱臼法处死小鼠，取全肺组织分成两部分，其中左肺置于10%的中性甲醛溶液中浸泡固定。

1.4.4外周血细胞计数

充分混匀肝素钠抗凝管中血液，用全自动血液分析仪检测。

1.4.5因子检测

取血清解冻，再次离心取上清液，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠血清MMP-9、TIMP-1含量(小鼠血清稀释5倍)。

1.4.6病理切片制作与HE染色

取小鼠肺组织在梯度酒精中脱水后置丙酮液过夜，于50 ℃石蜡液体中浸泡填蜡、包埋，切片(5μm)后展开粘于载玻片上并立即置70 ℃恒温箱烤片、过夜，二甲苯脱蜡，行苏木素-伊红染色，树胶封片等，常规显微镜观察肺病理结构并拍照。

1.5统计方法

2结果

2.1照射后小鼠一般情况

空白组小鼠活动度未见异常，实验组小鼠活动度减弱，饮食量下降，30 Gy剂量组小鼠活动度下降较15 Gy明显，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，随着照射后时间的延长，小鼠的活动度恢复，使用GSH后小鼠活动度明显较单纯照射组强(P<0.05)。见表1。

单纯照射后，小鼠外周血白细胞含量明显下降，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，30 Gy照射较15 Gy RILI更严重，随着照射时间的延长，外周血白细胞含量上升，与照射前比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

Table 1±s，cm2，n=20)

注：*，与空白组比较P<0.05.

Table 2±s，×109/L，n=5)

注：*，与空白组比较P<0.05；#，与照射前比较P<0.05.

照射后小鼠血小板含量下降明显，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，30 Gy照射较15 Gy下降更明显(P<0.05)，随着照射后时间延长，血小板急速下降后于第1 w起开始上升，与照射前比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

Table 3±s，×109/L，n=5)

注：*，与空白组比较P<0.05；#，与照射前比较P<0.05.

2.2照射后MMP-9表达情况

单纯照射后不同时间小鼠MMP-9表达量不同，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；30 Gy照射较15 Gy，MMP-9表达上升(P<0.05)，照射后1w MMP-9表达量上升达高峰再下降，与照射前对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

Table 4±s，×5ug/L，n=5)

注：*，与空白组比较P<0.05；#，与照射前比较P<0.05.

2.3照射后TIMP-1表达情况

不同照射剂量下，小鼠TIMP-1表达量不同，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与15 Gy剂量组比较，30 Gy剂量组TIMP-1表达量下降(P<0.05)；随着照射时间延长，TIMP-1表达量先急速下降，第2 w起再上升，较照射前升高(P<0.05)。见表5。

Table 5±s，×5 ug/L，n=5)

注：*，与空白组比较P<0.05；#，与照射前比较P<0.05.

2.4GSH防治RILI情况

我们在对不同照射剂量的RILI模型小鼠进行研究的同时使用GSH进行药物干预。15 Gy剂量照射下，使用GSH后MMP-9表达上调，较单纯照射组下降(P<0.05)，而30 Gy下，MMP-9表达上调较15 Gy+GSH组低。见表4。而小鼠活动度、白细胞、血小板和TIMP-1表达较单纯照射组升高，30 Gy剂量下GSH防治作用弱(P<0.05)。见表1~4。

2.5肺组织病理变化比较

空白对照组肺泡组织结构清晰，未见炎症细胞渗出、浸润， 照射后1 w小鼠肺组织中可见大量炎症细胞浸润伴肺泡间隔明显水肿、出血，30 Gy照射剂量较15 Gy，炎症严重、出血量多，照射后第2、3 w起症状减轻。使用GSH后，急性炎症减轻，出血量减少，30 Gy+GSH组小鼠肺结构损伤较15 Gy组严重，GSH在高剂量照射下防治能力有限。见图1。

图1　各组不同时间下小鼠肺组织病理变化图(HE staining，×400)

3讨论

据国外资料统计，急性RILI的发生率为5%~36%[3，4]，而有的研究者认为RILI发生率已达45%~60%，且有50%~90%的患者肺功能会下降，甚至因之死亡[5]。RILI是一系列的动态发生发展过程，分为早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纤维化[6]。

近年来针对RILI的相关研究已从传统的病理形态研究发展到了分子水平，细胞因子在其中发挥着重要的角色[7]，MMP-9作为MMPs家族中相对分子质量最大的酶，其正常表达具有调控和维持正常组织功能的特点，但在恶性肿瘤组织中，这种调控作用将消失[8]。TIMPs作为主要的MMPs监管系统，能够抑制ECM的降解而维持体内平衡[9]。有研究报道[10]，TIMP-1在放射性纤维化中高度表达，因此MMP-9和TIMP-1在RILI中有着重要的作用。GSH是一种带有巯基的还原剂，可以通过减少氧自由基的含量而发挥降低放射性损伤的作用[11]，我们通过建立小鼠胸部放射实验模型，腹腔注射240 mg/mL GSH 0.2 mL给予干预，探讨MMP-9、TIMP-1表达随放疗剂量的增加所呈现的相关变化趋势。

目前有许多动物实验模型用于RILI[12，13]。本研究发现，小鼠的活动度随着照射剂量的升高而下降，比空白组小鼠活动度明显降低，30 Gy剂量组明显低于15 Gy组小鼠活动度(P<0.05)，1 w后小鼠活动度明显较刚开始照射提高。照射后1 w小鼠白细胞、血小板急速下降，后慢慢上升，与照射前比较有统计学意义(P<0.05)，增加照射剂量后小鼠白细胞、血小板下降更明显，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。单纯照射3 w内，MMP-9先上升，1 w后达高峰，再慢慢下降，与放疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)，30 Gy照射组比15 Gy组MMP-9上升更明显(P<0.05)，剂量越高，放射损伤越重，而TIMP-1是先下降后上升，3 w后高于放疗前水平(P<0.05)。从肺HE染色病理可见，空白组小鼠3 w内未发生明显的炎症反应，肺泡结构清晰、完整，无炎症、红白细胞渗出。照射15 Gy后，1 w后可见肺脏出血，肺泡腔内有大量炎细胞浸润，随着照射后时间的延长，出血被吸收，炎性反应减轻，结构较清楚。而30 Gy组出血量、炎性反应、肺结构明显较15 Gy组严重，白细胞围绕肺泡壁大量聚集，损伤更严重。

本研究通过单次腹腔注射240 mg/mL GSH 0.2 mL后，小鼠的损伤修复能力明显较单纯照射组强。GSH能有效改善照射后小鼠的一般情况，一周内，小鼠平均活动度慢慢上升，基本能恢复到正常水平，白细胞、血小板恢复能力明显较单纯照射组强，表现出15 Gy+GSH组小鼠白细胞、血小板较15 Gy组上升速度快，而MMP-9水平低于单纯照射组，并且其下降速度也较15 Gy快，TIMP-1有相反趋势。肺结构较15 Gy组清晰、完整，尤其是在放射3 w后。30 Gy组GSH防治作用较15 Gy组低，表现出30 Gy+GSH 组小鼠MMP-9表达较15 Gy+GSH组高，而活动度、白细胞、血小板和TIMP-1相反。小鼠肺组织对辐射损伤具有一定的耐受能力，当放射剂量大于耐受能力时，肺组织微血管发生病理变化，肺功能发生改变，促进RILI发生，即使在GSH保护作用下，TIMP-1也难以恢复到15 Gy+GSH水平，与其他学者一致[14]。本研究采用的单次腹腔注射GSH后，由于药代学作用，机体短时间内将GSH代谢完，防治作用没有长期效应，表现出小鼠恢复能力后期较前期下降[15]，若要获得GSH长效的抗放射损伤作用，应多次运用GSH并密切监测其毒理反应等。

在临床放射治疗过程中，虽然低剂量多次照射更符合需求， 但目前许多学者也逐步关注全身立体定向治疗时的大分割照射模式，孙燕[16]等通过中肺合剂作用大鼠发现，中肺合剂组MMP-9表达下降，TIMP-1表达上升，Gao[17]等也发现，辐射组大鼠TIMP-1水平较对照组高。本研究采用15(30)Gy全肺单次照射成功地建立了典型的放射性肺炎小鼠实验动物模型，并发现30 Gy照射的小鼠，炎症等反应明显较15 Gy组严重，外周血白细胞与血小板均急速下降后再慢慢上升，与韩文秀[18]等研究相似。使用保护剂现象在国内中成药研究方面越来越热[19-21]，何振[22]等临床观察到乙酰半胱氨酸对肺癌RLI有一定的预防作用，Barnes[23]也认为中药黄芪具有保护放射损伤肺结构功能，且不影响放疗效果。本研究使用GSH后，小鼠外周血白细胞、血小板、MMP-9、TIMP-1表达和炎症反应均得到保护，与朱锦灿[24]等使用红景天苷预防辐射损伤小鼠研究结果相似。金晓光[25]等通过注入BLM致肺纤维化模型研究发现，不同时点大鼠纤维化肺组织有着不同的病理特点，模型组肺泡炎症明显较对照组严重。孟玲玲[26]等采用6 MV X线单次照射小鼠右肺30 Gy，观察至照射后2个月，发现使用苦参碱明显能减轻肺组织水肿、炎细胞浸润、上皮细胞和间质细胞增生等炎性反应，与本研究一样，高剂量照射易导致RILI，使用保护剂能明显降低放射损伤程度。Zhang[27]等认为放射诱导炎症时，氧化应激、炎细胞浸润及细胞因子的释放可引起凋亡基因表达增强，肺泡因上皮细胞凋亡，在RILI发生发展中可能起重要作用。

我们通过动物实验证实放疗会升高MMP-9表达，引起肺组织损伤，GSH在低剂量放疗下防治作用更强。但由于肺癌患者放疗是一种剂量逐渐增加模式，导致患者MMP-9表达量一直上升，而小鼠是给予单次剂量，MMP-9表达先上升后下降，这种复杂的过程不是相互独立的，放射线对肺组织的损伤受多方面因素影响。由于MMP-9随着放疗剂量增加而上升明显，可以说MMP-9作为比较客观的血清学指标，在放疗的早前进行检测既方便又可以保证质量，还可能预测RILI发生发展程度。

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收稿日期2015-06-09第36卷第4期

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.04.006

中图分类号R818

文献标识码A

瞿述根(1987~)，男，汉族，江西籍，2013级硕士研究生.△：通讯作者，教授，主任医师，E-mail：chfa1964@126.com