Annexin A2在类风湿性关节炎滑膜组织中的表达

Annexin A2在类风湿性关节炎滑膜组织中的表达

陈扬*

( 浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 311422)

摘 要目的：检测膜联蛋白（annexin）A2在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）滑膜组织中的表达，研究annexin A2与RA发生的相关性，期望能够在基因水平早期诊断和治疗RA，为明确RA的靶向性治疗提供帮助。 方法：采用real-time PCR技术检测annexin A2 mRNA在17例RA和15例骨性关节炎（osteoarthritis，OA）滑膜组织标本中的表达；采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色）对此32例滑膜组织标本进行了病理学观察，从炎性细胞浸润、纤维增生、滑膜细胞增生以及新生血管形成等4个方面加以评估。并比较两组的annexin A2 mRNA的相对表达量以及病理学观察评估结果。结果：annexin A2 mRNA在所有RA及OA滑膜组织样本中均有表达，但其在RA滑膜组织中的表达量显著高于OA滑膜组织（P<0.05）；HE染色显示RA组及OA组间炎性细胞浸润及纤维组织增生情况无显著性差异(P＞0.05)，但滑膜细胞增生及新生血管形成等病理改变存在显著性差异（P＜0.05），光学显微镜下在RA组可见滑膜细胞大量增生，且新生血管丰富，而这些在OA组少见。 结论：annexin A2与RA的发生关系密切，它的高表达可能在RA滑膜组织的病理改变中起到重要作用，有助于我们了解RA发生的分子生物学途径，进而为临床提供有针对性的治疗措施。

关键词类风湿性关节炎 annexin A2 real-time PCR HE染色

Expression of annexin A2 in rheumatoid arthritis synovial tissue

CHEN Yang*

(First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311422, China)

ABSTRACTObjective: To detect the expression of annexin A2 in rheumatoid arthritis synovial tissue, and to study the relationship between annexin A2 and the occurrence of rheumatoid arthritis (RA). Methods: The expression of annexin A2 mRNA in the synovial tissue samples of 17 cases of RA and 15 cases of osteoarthritis (OA) patients was detected by real-time PCR and their pathological observation was performed by HE staining, and four indicators such as inflammatory cell infiltration, fibrosis, synovial cell proliferation and angiogenesis were assessed. The levels of the relative expression of annexin A2 mRNA and the assessment results of pathological observation were compared between two groups. Results: Annexin A2 mRNA was expressed in both RA and OA synovial tissue samples but the amount of annexin A2 mRNA expression was significantly higher in the RA group than in the OA group (P＜0.05). HE staining showed that there were no significant differences in inflammatory cell infiltration and fibrous tissue hyperplasia but there were significant differences in pathological changes such as proliferation of synovial cells and neovascularization (P＜0.05). A large amount of synovial cell proliferation and rich angiogenesis could be found in the RA group but less in the OA group under optical microscope. Conclusion: There is a close relationship between annexin A2 and the occurrence of RA, and the high expression of annexin A2 mRNA may play an important role in pathological changes of RA synovial tissue, which can help us understand a way of molecule biology for the occurrence of RA.

KEY WORDSrheumatoid arthritis; annexin A2; real-time PCR; HE staining

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以致残性关节病变为主的自身免疫性疾病，其病理特征主要表现为滑膜细胞异常增殖和炎性细胞浸润，累及周身关节滑膜炎及血管翳形成，严重时可导致滑膜增厚，形成侵袭性血管翳，侵蚀软骨与骨导致关节破坏，全世界约有1%的人患有此病，5～10年致残率高达60%[1]。

但其发病原因至今仍未明确，不过可以肯定的是RA是多因子、多步骤、多阶段的演进过程[2]。因此寻找与RA发生发展相关的敏感因子对其早期诊断及治疗有着重要意义。

annexin A2是一类钙依赖性膜磷脂结合蛋白，它参与细胞增殖、分化、凋亡和迁移等重要生命过程[3]。近年来国内外很多学者发现annexin A2的高表达与RA的发生密切相关[4-5]，但其在RA发生发展中的作用机制却鲜见报道。本研究应用real-time PCR来评估RA滑膜组织中annexin A2 mRNA表达，HE染色观察RA滑膜组织病理情况，判断annexin A2的表达和RA的发生发展是否相关。为明确RA发生的分子生物学途径提供思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集浙江中医药大学附属第一医院骨伤科2013年3月-2014年6月膝关节置换术切除的类风湿性关节炎（RA）滑膜组织标本17例，骨性关节炎（osteoarthritis, OA）滑膜组织标本15例。每一个标本的收集都取得了患者知情同意。所有RA患者均符合美国风湿病学会（ACR）1987年修订的诊断标准[6]：①早起关节僵硬至少l h（≥6周）；②3个以上关节肿胀（≥6周）；③手关节或掌指关节或近端指间关节肿胀（≥6周）；④对称性肿胀；⑤手的X线改变。⑥皮下结节；⑦类风湿因子阳性。如具备4项以上指标即可确诊。所有OA患者均根据1995年美国风湿病协会修订的诊断标准[7]，即：①一个月来大多数时间发生膝痛；②X线片示关节边缘骨赘；③关节液检查符合骨关节炎（清晰、黏稠、WBC＜2×109/L）；④年龄≥40岁；⑤晨僵≤30 min；⑥关节活动时有关节摩擦音，诊断标准：①②确诊或①③⑤⑥确诊或①④⑤⑥确诊。所有标本离体后迅速放置于-80℃超低温冰箱保存。

1.2 实验主要仪器与试剂

主要仪器：iQ5 PCR仪（美国Bio-Rad公司）、台式高速离心机（德国Heraeus公司）、超低温冰箱（日本SANYO公司）、台式恒温振荡器（江苏太仓实验仪器厂）、恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）、超净工作台（苏州三兴净化公司）、紫外分光光度仪（美国Thermo公司）、切片机（德国Microm公司）等均由浙江中医药大学动物实验室提供。

主要试剂：HE染色试剂盒（江苏碧云天）；荧光定量试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time））、RNA提取试剂（Takara RNAiso Plus）、逆转录试剂盒（PrimeScriptTM RT reagent）均购自Takara公司。荧光定量PCR引物序列由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成。

1.3 实验方法

1.3.1 annexin A2 mRNA表达的检测

将收集的滑膜组织标本放入-80 ℃冰箱保存待检，提取总RNA时将标本置于装有液氮的研钵中研磨呈粉末状，加入1 ml RNAiso plus（Takara公司），按说明书操作提取RNA，并测定RNA的浓度、纯度及完整性。逆转录反应按照RT-reagent逆转录试剂盒（Takara公司）说明书进行，将逆转录反应体系加到无RNase的PCR管内，42 ℃ 40 min，95 ℃ 5 min，将获得的cDNA保存于4 ℃冰箱备用。

annexin A2基因扩增上游引物：5’-TCTACTGTTCACGAAATCCTGTG-3’，下游引物：5’-AGTATAGGCTTTGACAGACCCAT-3’，扩增长度：90 bp。内对照GAPDH上游引物：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游引物：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’，扩增长度：143 bp。荧光定量PCR反应按Takara公司产品说明书操作：将cDNA用实时荧光定量PCR仪进行扩增，95 ℃预变性3 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃（退火温度根据不同引物而不同）退火30 s；总共48个循环。熔解曲线：从55 ℃开始，每30 s升高0.5 ℃，直到95 ℃，循环一次。实验总共重复3次。

所有反应信息资料由iQ5 PCR仪收集，Ct值通过该PCR仪内置的相对定量分析软件来测量和计算，转录水平通过比较阈值法计算[8]，计算方法是，△△Ct=实验组△Ct（目的基因Ct值-内参基因Ct值）-对照组△Ct（目的基因Ct值-内参基因Ct值）。计算2—△△Ct作为目的基因的相对表达量。

1.3.2 滑膜组织病理观察

解冻RA组及OA组滑膜组织，于40%福尔马林溶液中保存，常规脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色。光学显微镜下观察两组滑膜增生、新生血管、炎性细胞浸润及纤维组织增生等病理学变化，根据Tsubaki等[9]相

关文献进行评分（表1）。

表1 各组滑膜HE染色评分的4项标准

1.4 统计分析

应用SPSS 19.0统计软件包，两组annexin A2 mRNA的相对表达量以及HE染色评分结果以均数±标准差（x±s）表示，两组数据间差异分析采用独立样本t检验，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 annexin A2 mRNA的表达

real-time PCR扩增内参照GAPDH、RA及OA滑膜组织中的annexin A2基因，结果表明扩增为特异性扩增，产物为目的基因，而不是引物二聚体，定量准确。经检测发现所有RA及OA滑膜组织样本均有annexin A2 mRNA的表达，其相对表达量以（x±s）表示（表2）。经两组间独立样本t检验，发现annexin A2 mRNA的相对表达量在RA滑膜组织中明显高于OA滑膜组织，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 annexin A2 mRNA在滑膜组织中的表达量

2.2 HE染色观察滑膜组织病理情况

正常情况下，由1～2层滑膜细胞及滑膜下层组成滑膜衬里层，且只有少量纤维组织和血管，无炎性细胞浸润。RA组及OA组均有大量炎性细胞浸润，且有纤维组织增生，但OA组少见滑膜细胞增生及新生血管形成，而RA组光学显微镜下可见滑膜细胞大量增生，可达8层以上，且新生血管丰富（图1）。两组HE染色评分经独立样本t检验发现，炎性细胞浸润及纤维组织增生情况无显著性差异（P＞0.05），但是滑膜细胞增生及新生血管形成等病理改变存在显著性差异（P＜0.05，表3）。

图1 OA组与RA组滑膜组织病理切片对比

表3 各组滑膜组织HE染色评分（x ±s）

3 讨论

annexin A2以往多见于其与恶性肿瘤、血液病及抗磷脂综合征等疾病的相关性研究报道，而近年来Salle等[4]国内外学者发现RA患者中存在annexin A2的高表达，提示其与RA的发展密切相关。而Goulding等[10]早在1995年的研究报道中指出在包括内衬层的类风湿标本染色后，在血管周围和组织间质的巨噬细胞内，annexin A2有着与annexin A1类似的分布，尤以血管周围的分布最为突出。同时Bo等[11]通过对人类关节炎滑膜成纤维细胞的差异蛋白质组分析提示annexin A2可能成为治疗RA的新靶点。本研究表明，annexin A2 mRNA在RA和OA的滑膜组织中均有表达，但其表达量在RA滑膜组织中明显高于OA滑膜组织，且差异具有统计学意义。RA和OA在滑膜病变过程中均有大量炎性细胞浸润和纤维组织增生，但RA滑膜组织同时存在大量滑膜细胞的增生以及血管翳的形成，且这种病理改变差异具有统计学意义。因此本研究更进一步证实了annexin A2与RA发生及发展的相关性。

有研究报道annexin A2可能通过TLR4激活巨噬细胞[12]，从而上调炎症反应；AIIt作用于人单核源性巨噬细胞后可导致促分裂原活化蛋白激酶快速磷酸化和NF-κB的激活[13]，并促进TNF-α、IL-1β和IL-6等大量可趋化白细胞的细胞因子分泌。这些均暗示annexin

A2对炎症反应进展有级联放大作用。本研究表明其相对表达量在RA滑膜组织中明显高于OA滑膜组织，且这种差异具有统计学意义。RA和OA在滑膜病变过程中均有大量炎性细胞浸润，因此表明annexin A2与RA和OA可能在滑膜炎性改变存在较大的相关性，但annexin A2 在RA滑膜组织中的高表达并没有引起两组滑膜组织炎性细胞浸润的显著性差异，其在RA滑膜组织炎性反应中所起的具体作用机制值得进一步研究，尤其是annexin A2的各种存在形式在炎症反应中所起的不同作用。

本研究发现RA滑膜组织同时存在大量血管的增生以及血管翳的形成，且有研究指出annexin A2与血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达相关联[14]，而VEGF亦是促进RA滑膜血管翳形成的最重要的细胞因子[15]。Nagashima等[16]通过免疫组化技术发现，VEGF在RA的滑膜衬里巨噬样滑膜细胞、血管平滑肌细胞和关节软骨细胞中表达。由此说明annexin A2在RA的特异性的病理变化中起到较为关键的作用。

annexin A2参与细胞增殖，与肿瘤的发生发展、浸润、远处转移均有不同程度相关[17]，而RA累及周身关节的增生性和侵蚀性滑膜炎的临床特点极类似于“局限性恶性肿瘤”的增生性和破坏性病变，呈进行性发展[18]，由此进一步表明了annexin A2在RA滑膜组织中的高表达在RA病理改变中的独特意义。

总之，annexin A2与RA发生关系密切，其可能通过调控炎性细胞浸润，促进滑膜细胞增殖，参与滑膜血管翳形成，以及刺激破骨细胞分化成熟，从而导致关节的破坏，造成关节功能障碍，甚至致残。但其在RA发生、发展及转归中的具体作用途径仍有待进一步的探索和拓展。我们相信随着对annexin A2与RA发展关系的深入研究及阐明，annexin A2有望被用于类风湿性关节炎的早期检测、辅助诊断及治疗的靶向分子，进而为临床提供有针对性的治疗措施。

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收稿日期：（2015-02-02）

作者简介：*陈扬（1989-），男，在读硕士研究生。研究方向：骨伤外科。E-mail：chen19891022@126.com

文章编号：1006-1533(2015)09-0045-04

文献标识码：A

中图分类号：R593.22