新疆核桃分心木总皂苷和总黄酮的体外抗氧化活性

令狐晨， 谢姆西努尔·阿卜来提， 阿依吐伦·斯马义

(新疆医科大学 药学院， 新疆 乌鲁木齐　830011)



新疆核桃分心木总皂苷和总黄酮的体外抗氧化活性

令狐晨， 谢姆西努尔·阿卜来提， 阿依吐伦·斯马义*

(新疆医科大学 药学院， 新疆 乌鲁木齐830011)

摘要：为了研究新疆核桃分心木中总皂苷和总黄酮的抗氧化活性，以VC作为阳性对照，检测了核桃分心木中总皂苷和总黄酮对超氧阴离子(-O2)、羟基自由基(-OH)、DPPH等的清除作用，并对总皂苷和总黄酮的还原能力进行了测定.结果表明：总皂苷和总黄酮均具有较好的对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基等的清除能力和铁还原能力，并在一定的质量浓度范围内成量效关系.核桃分心木总皂苷和总黄酮均具有较强的抗氧化活性.

关键词：核桃分心木; 总皂苷; 总黄酮; 抗氧化

0引言

新疆核桃分心木(DiaphragmaJuglandisFructus)是胡桃科核桃属植物——核桃的果核内的木质隔膜，其多弯曲、破碎而不整齐；表面呈淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光泽；质脆，易折断，气微，味微苦.核桃分心木主要用于治疗肾虚、遗精、滑精、遗尿、尿血、带下、泻痢等症[1-3].

抗氧化剂主要是通过终止自由基链反应从而清除自由基，起到保护机体的作用.因此，寻找适当的外源性抗氧化剂清除体内自由基，对治疗疾病和保护人体健康很有益处.

植物中存在众多消除活性氧自由基的抗氧化剂.已有文献报道，植物中的黄酮[4]、皂苷[5]等活性物质具有一定的抗氧化活性，但有关核桃分心木总皂苷和总黄酮的体外抗氧化活性研究在国内外却尚未见相关报道，导致人们对分心木的药用价值没有充分地认识，严重浪费了该药用资源.

为合理利用该植物资源并确定其主要的抗氧化活性成分，本实验通过提取核桃分心木总皂苷及总黄酮成分，研究了其体外抗氧化活性，从而为探索核桃分心木这种维药的药理作用机制提供了基础，并为核桃分心木的综合开发提供了理论依据.

1实验部分

1.1　材料与试剂

齐墩果酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号YY20110428)；芦丁标准品(上海源叶生物科技有限公司，批号YA0709SA14)；核桃分心木(购于新疆和田地区，由新疆医科大学药学院帕丽达·阿布利孜教授鉴定为胡桃科植物胡桃果核的干燥木质隔膜)；高氯酸、冰醋酸、甲醇、浓硫酸、乙醇、石油醚、正丁醇、DPPH溶液、水杨酸、硫酸亚铁溶液、双氧水、磷酸盐缓冲溶液(pH=8.2)、邻苯三酚、乙酸乙酯、盐酸、铁氰化钾、三氯乙酸等均为分析纯试剂，均购于天津富宇精细化工有限公司.

1.2　仪器与设备

UV2250型紫外可见分光光度计(日本岛津)；EYELAN-1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；SK3200H型超声清洗仪(上海汉克科学仪器有限公司)； ABl04-N型多功能电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；FW135型粉碎机(北京永光明医疗仪器厂).

1.3　实验方法

1.3.1核桃分心木总黄酮的提取

称取核桃分心木50 g，加入400 mL 50%的乙醇溶液，同时放入到超声清洗机中进行超声20 min，对溶液进行过滤，弃滤渣，浓缩滤液得浸膏，浸膏加入200 mL水溶解，用200 mL的石油醚萃取3次，石油醚层弃去，再用乙酸乙酯200 mL萃取，萃取3次，将乙酸乙酯萃取液合并浓缩，得总黄酮样品，加50%乙醇定容至100 mL[6].

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系吸光光度法测定总黄酮的含量[7].以芦丁为对照品，标准曲线为A=12.369C-0.015 8(r=0.999 9)，其中,吸光度(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标，检测波长为506 nm，测定其提取率及质量浓度.

1.3.2核桃分心木总皂苷的提取

称取核桃分心木25 g，加入80%乙醇625 mL，80 ℃水浴回流提取2 h，回流2次，过滤，水浴挥干，加蒸馏水适量超声使其溶解，用等体积的正丁醇萃取3次，将正丁醇萃取液合并并浓缩，得总皂苷的样品，加80%乙醇定容至100 mL.

采用5%香草醛-冰醋酸-高氯酸显色体系吸光光度法测定总皂苷的含量[8].以齐墩果酸为对照品，标准曲线为A=39.221C-0.026 4(r=0.999 2)，其中,吸光度(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标，检测波长为563 nm,测定其提取率及质量浓度.

1.3.3DPPH自由基清除能力测定[9]

用制备的总黄酮和总皂苷分别配成浓度合适的样品溶液1 mL，加入4 mL浓度为0.004%的DPPH溶液，摇匀，室温下避光反应30 min，在517 nm处测其吸光度Ai;取4 mL不同浓度的样品液，加入1 mL甲醇测定吸光度值为Aj;取4 mL 0.004% DPPH溶液,加入1 mL甲醇测定吸光度值为A0.重复三次，分别计算样品对DPPH的清除率.计算公式为：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]*100% .

1.3.4羟基自由基清除能力测定[10]

取1 mL浓度为4.5 mmol·L-1的硫酸亚铁，加入1 mL浓度为4.5 mmol·L-1的水杨酸-乙醇溶液，再加不同浓度的样品液1 mL，最后加1 mL 4.4 mmol·L-1的H2O2反应，于37 ℃水浴中反应30 min，在510 nm处测吸光值.用1 mL蒸馏水代替1 mL不同浓度的样品液所测得样品的吸光值为A0；用1 mL样品液代替1 mL蒸馏水所测得样品的吸光值为Ax；用1 mL蒸馏水代替1 mL双氧水所测得的吸光值为Axo.重复三次，清除率按下式计算：

清除率(%)=[1-(Ax-Axo)/A0]*100%.

1.3.5超氧阴离子自由基清除能力测定[11]

采用邻苯三酚自氧化法[12,13]，取5 mL 0.15 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH=8.2)与1 mL样品液混合，于25 ℃恒温水浴15 min，加入0.2 mL浓度为45 mmol·L-1的邻苯三酚，摇匀，在第四分钟时加入10 mol·L-1盐酸1滴终止反应，于325 nm处测定样品吸光值为A1；用0.2 mL蒸馏水代替0.2 mL的45 mmoL·L-1邻苯三酚所测定的吸光值为A2；用1 mL溶剂代替1 mL样品液所测定的吸光值为A3.重复三次，清除率按下式计算：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]*100%.

1.3.6Fe3+还原能力测定

将0.25 mL不同浓度的样品液、0.25 mL pH 6.6的磷酸缓冲溶液和0.25 mL1%的铁氰化钾混合，于50 ℃水浴20 min后加入10%三氯乙酸溶液0.25 mL，500 r·min-1离心10 min,取上清液0.5 mL加蒸馏水2.5 mL和0.2%三氯化铁溶液0.1 mL，摇匀,室温下静置10 min，在700 nm 处测吸光值.

1.3.7统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件计算IC50.

2结果与讨论

2.1　总皂苷和总黄酮的含量

经计算，核桃分心木总皂苷的提取率为2.7%，在实验中定容至100 mL的总皂苷提取液中，总皂苷的质量浓度为6.78 mg·mL-1.

核桃分心木总黄酮的提取率为4.2%，在实验中定容至100 mL的总黄酮提取液中，总黄酮的质量浓度为21.02 mg·mL-1.

2.2　对DPPH自由基的清除能力

如图1所示，核桃分心木总皂苷和总黄酮对DPPH自由基具有较强的清除能力.总皂苷和总黄酮在实验浓度范围内，对DPPH自由基的清除能力呈现量效关系.当总皂苷的浓度为5 ug·mL-1时，其清除率为32.74%.随着总皂苷质量浓度的增大，其清除能力增加；当总黄酮浓度为16 ug·mL-1时，其清除率为28%.随着总黄酮质量浓度的增大，其清除能力增加.当总黄酮的质量浓度为64 ug·mL-1时，清除率基本达到最大值70.3%，此后再增加总黄酮的质量浓度，清除率基本无明显变化.

VC、总皂苷、总黄酮的IC50分别为9.428 ug·mL-1、8.296 ug·mL-1、44.291 ug·mL-1.从IC50数据可知，总皂苷在清除DPPH自由基的能力方面基本和VC相当，而总黄酮的效果不如VC.

图1　VC、分心木总皂苷和总黄酮对DPPH自由基的清除能力

2.3　对羟基自由基的清除能力

核桃分心木对羟基自由基的清除能力结果如图2所示.由图2可以看出，总皂苷和总黄酮对羟基自由基都表现出了一定的清除能力，且在实验浓度范围内呈现量效关系.总皂苷和总黄酮在质量浓度为0.6 mg·mL-1时，其清除率分别为36%、23.7%.随着质量浓度的增大，两者清除能力增加.当质量浓度增加到1.6 mg·mL-1时，两者的清除率基本达到最大值.此后，继续增加质量浓度，两者的清除率均基本无明显变化.

VC、总皂苷、总黄酮的IC50分别为0.054 mg·mL-1、0.934 mg·mL-1、1.193 mg·mL-1.从IC50数据可知，总皂苷和总黄酮对羟基自由基的清除能力不如VC，但总黄酮和总皂苷两组在浓度梯度之间存在差异性(p<0.05)，在相同浓度下，总皂苷对羟基自由基的清除能力比总黄酮强.

图2　VC、分心木总皂苷和总黄酮对羟基自由基的清除能力

2.4　对超氧阴离子自由基的清除能力

由图3可知，总皂苷和总黄酮在清除超氧阴离子自由基方面有着较强的能力,且在实验质量浓度范围内呈现量效关系.总皂苷质量浓度在1~8 mg·mL-1之间时，对该自由基的清除率为38.65%～85.4%；总黄酮质量浓度在1～8 mg·mL-1之间时，对该自由基的清除率为31.9%~75.4%.

VC、总皂苷、总黄酮的IC50分别为0.103 mg·mL-1、2.208 mg·mL-1、3.340 mg·mL-1.从IC50数据可知，总皂苷和总黄酮在对超氧阴离子自由基的清除能力方面不如VC，但总黄酮和总皂苷两组在浓度梯度之间存在差异性(p<0.05)，在相同浓度下，总皂苷对超氧阴离子自由基的清除能力比总黄酮强.

图3　VC、分心木总皂苷和总黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力

2.5　Fe3+还原能力测定

由图4可以看出，在实验浓度范围内，总皂苷和总黄酮的还原能力与其质量浓度成明显的量效关系.总皂苷和总黄酮的还原效果都不如VC，但是总黄酮和总皂苷具有一定的抗氧化性.

图4　VC、分心木总皂苷和总黄酮的Fe3+还原能力测定

3结论

据报道，抗氧化剂能够预防各种由自由基引起的与老化相关的疾病.例如，动脉硬化、糖尿病、心血管病、老年性痴呆、白内障、关节炎等，这些疾病都被认为与自由基相关[14,15].传统合成的抗氧化剂具有副作用，不易长期使用.故从植物中寻找天然的抗氧化剂越来越受到研究者的关注.目前，有关核桃分心木的抗氧化活性方面鲜有报道，因此，对核桃分心木药材的认识不充分，造成了药用资源的浪费.

本实验研究了核桃分心木总皂苷和总黄酮的体外抗氧化活性.实验结果表明：总皂苷和总黄酮都具有一定的体外抗氧化活性，均具有较好的DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力和铁还原能力.但是,其抗氧化性方面都比VC弱，可能原因是总黄酮和总皂苷含有一定的杂质，并不是单一的化合物.

本实验对核桃分心木抗氧化活性进行了初步研究，为进一步对核桃分心木分离纯化所得单体的药理活性的研究奠定了基础，亦为开发利用核桃分心木药用资源提供了一定的理论基础.

今后的研究将对总皂苷和总黄酮进行进一步分离、纯化、鉴定，以得到单体成分，并探讨抗氧化的单体成分，这可为更深入的生物活性研究及药材开发提供理论参考.

参考文献

[1] 阿巴拜克热·热合曼.维吾尔医常用生药(维吾尔文)[M].乌鲁木齐：新疆人民卫生出版社，2004.

[2] 穆塔力甫·艾力,阿吉·艾米提.维吾尔医常用草药(维吾尔文)[M].乌鲁木齐：新疆人民卫生出版社，2005.

[3] 全国中草药汇编编写组.中草药大辞典[M].北京:人民卫生出版社,1975.

[4] 吴晓宁,余陈欢,徐静红.乌蕨总黄酮体外抗氧化活性的研究[J].医药导报,2010,29(3)：292-294.

[5] 赵志敏,南艳平,唐青涛,等.无患子总皂苷的体外抑菌及抗氧化活性研究[J].时珍国医国药,2013,24(4):799-801.

[6] 刘德胜,郑红,韩景田.茅莓总黄酮提取工艺的优化[J].湖北农业科学,2012,51(9)：3 295-3 297.

[7] 师梅梅,杨建雄,任维.荔枝草总黄酮的体外抗氧化研究[J].陕西师范大学学报(自然科学版),2012,40(5)：60-63.

[8] 朱青梅,令狐晨,阿依吐伦·司马仪.新疆核桃分心木总皂苷的提取纯化工艺研究[J].西北药学杂志,2015,30(1)：20-23.

[9] 米娜瓦尔·哈帕尔,艾尼瓦尔·吾买尔,阿孜古丽·吐尔逊,等.维药罗勒提取物中总黄酮含量及其抗氧化活性研究[J].新疆医科大学学报,2012,35(6)：736-739.

[10] 卢化,张义生,郭胜男,等.银木总黄酮体外抗氧化活性研究[J].中国药师,2015,18(4)：556-557.

[11] 黄秋洁,叶勇,欧贤红,等.两种药用植物总黄酮体外抗氧化活性比较[J].医药导报,2013,32(5)：576-578.

[12] 张娜,杨保求,王倩,等.枣核黄酮类物质的抗氧化性研究[J].安徽农业科学,2010,38(5)：2 037-2 039.

[13] 韩少华,朱靖博,王妍妍.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J].食品科技,2009,27(6)：155-157．

[14] 宋填,李庆勇,王春成,等. 独角莲块茎的体外抗氧化活性及成分研究[J].中成药,2012,34(1)：159-161.

[15] 黄红英,邓斌,蒋刚彪.苦竹叶总黄酮的超声提取及其抗氧化研究[J].时珍国医国药,2009,20(6)：1 443-1 445.

【责任编辑：晏如松】

In vitro antioxidant activity of saponins and flavonoids

from xinjiangDiaphragmaJuglandisFructus

LINGHU Chen, Xmnuer·Abulaiti, Aytulun·Simayil*

(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Abstract:To research antioxidant activity in vitro of total saponins and total flavonoid from Diaphragma Juglandis Fructus,Using VC as a positive control,the antioxidant activity in vitro of total saponins and total flavonoid from Diaphragma Juglandis Fructus were evaluated by scavening rates against DPPH,superoxide anion,hydroxyl radicals and ferric reduing antioxidant power.The results showed that both total saponins and total flavonoid had savening effects on DPPH,superoxide anion,hydroxyl radicals and ferric reduing antioxidant power.Over the studied concentration range,the radical scavening activity had a dose-effect relationship.Total saponins and total flavonoid from Diaphragma Juglandis Fructus have strong antioxidant activity.

Key words:Diaphragma Juglandis Fructus; total saponins; total flavonoids; antioxidant activity

中图分类号：R285

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2016)01-0134-04

通讯作者:阿依吐伦·斯马义(1959-),女，乌孜别克族，新疆乌鲁木齐人，教授，硕士生导师,研究方向：药物分析和天然药物化学，aytulunss@126.com

作者简介:令狐晨(1992-)，女，山西运城人，在读硕士研究生，研究方向：新疆地方药用植物

基金项目：乌鲁木齐市科学技术计划项目(Y121310009)