联合应用姜黄素与神经干细胞治疗脊髓损伤的实验研究

许长春　许可鹏

【摘要】目的探讨联合应用姜黄素与神经干细胞治疗脊髓损伤的效果。方法选取30只成年Wistar大鼠，将模型动物随机分为三组：正常组、损伤组及联合移植组，每组10只。观察三组的BBB评分，诱发电位潜伏期及板试验角度值的变化。结果联合移植组的1，2，4，8周的BBB评分皆明显高于损伤组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。而两组的BBB评分显著低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。大鼠CSEP的波形为“W”形，所有大鼠在术前和正常组术后的潜伏期正常。4周后，联合移植组出现“W”形，但是诱发电位潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.05）。自损伤后1周起，各时间点损伤组及联合移植组大鼠行斜板试验角度值均逐渐上升，联合移植组所测得角度值均大于单纯损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论联合应用姜黄素与神经干细胞治疗脊髓损伤，可以激活Wnt/p-catenin信号通路使脊髓损伤后部分内源性神经干细胞向神经元方向分化，减轻胶质瘢痕，从而改善大鼠后肢功能的恢复。

【关键词】姜黄素；神经干细胞；治疗；脊髓损伤；联合应用；临床疗效

【中图分类号】R651.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-0616（2015）21-30-04

脊髓损伤（spinal cotd injury，SCI）是一种严重的中枢神经系统（central nervous system，CNS）创伤，目前尚无有效的治疗手段。传统观念认为，困扰脊髓损伤后神经功能修复的关键问题是损伤的神经组织及细胞无法再生。干细胞的发现使中枢神经系统损伤的研究进入了新的领域。目前，SCI后的细胞替代治疗已成为神经功能修复的热点问题。常用的方法有外源性干细胞移植与激活并诱导内源性神经干细胞（endogenous neural stemcells，ENSCs），与外源性干细胞移植相比，激活并诱导内源性神经干细胞来修复脊髓损伤，不存在安全及伦理问题，其新生的神经组织细胞在与机体整合上具有同源性，不存在排斥反应。本研究通过联合应用姜黄素与神经干细胞干预大鼠脊髓挫伤模型，观察损伤后大鼠神经功能修复情况，分析其效果，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

30只成年Wistar大鼠，体重（250.0±50.0）g，雌雄不拘，合格证号00005907，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。将模型动物随机分为三组：正常组、损伤组及联合移植组，每组10只。三组月龄、体重等一般资料比饺，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2脊髓损伤模型的制备

动物腹腔麻醉后，背部剪毛，常规碘酒酒精消毒。沿脊柱正中切开皮肤，分离肌肉，暴露椎骨，用咬骨钳仔细咬去椎板，在T₉与T₁₁椎骨平面打开椎管，充分暴露T₁₀节段脊髓背面及两侧，用弯头眼科镊将脊髓轻轻挑起，用眼科剪将脊髓完全剪断，将分离的肌肉缝合封闭椎管缺损，缝合皮肤，制成脊髓损伤模型。

1.3方法

正常组：仅行切皮、打开椎管，不施行SCI。

损伤组：脊髓全横断损伤。

联合移植组：在脊髓完全横断后1周移植大鼠NSCs悬液+姜黄素组（500nmol/L）。

1.4神经干细胞的提取、培养及鉴定

取孕14.5d左右的SD大鼠。常规消毒后用5mL注射器按0.06mL/10g剂量抽取适量5%水合氯醛腹腔麻醉，胚胎组织取出于无菌PBS中清洗，取胚胎额顶部2/3组织于盛有适量基础培养基的培养皿中，用刀片小心切碎后用200目滤网滤过，以去除大的组织块、血管、脑膜等组织。用5mL枪头小心用力均匀吹打15～20次，再经过400目细胞筛过滤来制成单细胞悬液。将制好的单细胞悬液分装到25mL无菌培养瓶，置于恒温培养箱孵育中进行培养。Nestin抗体及荧光二抗进行标识。

1.5BBB功能评分评价大鼠下肢功能行为学检测参照Basso等提出的大鼠SCI后功能评判标准（简称BBB评分法）对各实验动物后肢的运动功能进行评分。所有观察都在上午进行，评分前应将所有动物的膀胱排空，时间为4min，评分时采用双盲法。分别对损伤后1，2，4，8周的BBB评分进行比较。

1.6动物皮层体感诱发电位（CSEP）的测定

模型动物在术后1d及9周行CSEP检查。每只动物均测双下肢。

1.7斜板试验

将厚度为1cm表面带有沟槽的胶垫固定于一木板上，在术前及术后相应时间点将大鼠置于测试斜板上，斜板一端位置固定，另一端由水平位，即0度角逐渐升高，直至大鼠在斜板上所处位置无法停留达到5s时，用电子角度尺测量斜板与地面之间的夹角，获得该次斜板试验的角度值。每只大鼠共进行三次斜板试验，取平均值。

1.8统计学处理

采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以百分比表示，采用x²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1脊髓组织标本形态观察

假手术组脊髓组织形态正常，表面光滑，呈白色，横截面呈椭圆形。单纯损伤组及姜黄素干预组在脊髓夹伤后即刻便可见损伤部位一横行血肿带。损伤后1d脊髓组织标本可见夹伤部位有一暗红色、宽约1mm的横行出血带，自损伤部位向上及向下2～3个脊髓节段可见脊髓实质弥散性出血，呈红褐色，但脊髓外观大体形态基本正常。损伤后1周脊髓组织标本可见血肿大部分吸收，脊髓钳夹部位可见一呈淡黄色的横行损伤带。自损伤后2周起脊髓背侧因缺乏椎板骨质，与周围肌肉或软组织粘连明显，出血基本吸收完全，损伤部位开始出现较明显的缩窄，随时间推移上述情况逐渐加重，至8周时单纯损伤组损伤节段缩窄明显，损伤部位上下端脊髓连接疏松，在剥离脊髓过程中如操作不慎极易离断，部分标本在强光下可见损伤部位脊髓实质中有囊腔形成。endprint

2.2大鼠脊髓损伤后各时间点BBB评分

联合移植组的1，2，4，8周的BBB评分皆明显高于损伤组两组比较，差异有统计学意义（P<0.05），两组的BBB评分显著低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3三组动物的皮层体感诱发电位潜伏期比较

大鼠CSEP的波形为“W”形，所有大鼠在术前和正常组术后的潜伏期正常。4周后，联合移植组出现“W”形，但是诱发电位潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.05），提示脊髓传导速度明显下降。见表2。

2.4三组大鼠脊髓损伤后各时间点斜板试验角度值比较

自损伤后1周起，各时间点损伤组及联合移植组大鼠行斜板试验角度值均逐渐上升，联合移植组所测得角度值均大于单纯损伤组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3讨论

脊髓损伤是一种严重致残性神经系统创伤性疾病，伤后立即出现损伤水平以下运动、感觉和括约肌功能障碍。世界范围总发生率为每年12.1～57.8/百万人，交通意外及高处坠落为最常见致伤因素。至今尚无有效的治疗措施。

脊髓损伤的病理生理过程经历了由机械外力引起的原发性损伤并触发级联反应导致继发性损伤，细胞损害由最初的损伤部位向临近区域及远侧的白质及灰质扩散。对继发性损伤的研究提示众多有害因素同时出现，包括缺血、自由基的产生、脂质过氧化及有害的离子流等进一步加剧损伤程度。

由于脊髓损伤是突发机械性创伤导致的出血、组织坏死，原发损伤及继发损伤多种相关的病理生理改变恰好与姜黄素的抗氧化、抗纤维化、抗炎、抗胶质细胞等特性相契合。因此，我们将姜黄素作为干预措施，观察其对预防和治疗脊髓损伤的功效。

姜黄素（curcmnin）是姜科姜黄属植物根茎的提取物，作为传统中药材，广泛应用于风湿病、发热、肠道疾病、外伤、闭经等，当代研究表明姜黄素对炎症、神经退行性疾病、心血管疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等多种疾病均有疗效而无明显毒副作用。近年来对中枢神经系统损伤的研究显示姜黄素具有明显的神经保护作用，并且姜黄素可刺激胚胎神经前体细胞增殖，也可增强成年海马的神经发生。

本研究中，联合移植组的1，2，4，8周的BBB评分皆明显高于损伤组，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。而两组的BBB评分显著低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。大鼠CSEP的波形为“W”形，所有大鼠在术前和正常组术后的潜伏期正常。4周后，联合移植组出现“W”形，但是诱发电位潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.05）。自损伤后1周起，各时间点损伤组及联合移植组大鼠行斜板试验角度值均逐渐上升，联合移植组所测得角度值均大于单纯损伤组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

综上所述，联合应用姜黄素与神经干细胞治疗脊髓损伤，可以激活Wnt/p-catenin信号通路使脊髓损伤后部分内源性神经干细胞向神经元方向分化，减轻胶质瘢痕，从而改善大鼠后肢功能的恢复。endprint