miR-222基因转染对人非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭的影响

罗湘玉，罗卫民，张军，林称意，郭家龙(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北十堰442000)

miR-222基因转染对人非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭的影响

罗湘玉，罗卫民，张军，林称意，郭家龙
(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北十堰442000)

摘要:目的miR-222基因转染对人非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭的影响。方法采用qRT-PCR检测miR-222在A549、16HBE细胞中的表达;将miR-222 mimics、scramble、TIMP3-siRNA与si-control分别转染于A549细胞(设为实验1组、实验2组、实验3组、实验4组)，Western blotting法检测细胞中的TIMP3蛋白，MTT法和Transwell侵袭实验分别检测细胞增殖与侵袭能力。结果miR-222在A549、16HBE细胞的表达分别为0.767±0.086、0.405 ±0.034，两者比较，P＜0.01。实验1组、实验2组、实验3组、实验4组A549细胞中TIMP3蛋白表达分别为0.416 ±0.023、0.732±0.019、0.430±0.020与0.803±0.025，实验1组与实验2组比较，实验3组与实验4组比较，P均＜0.05。在A549细胞中过表达miR-222或沉默TIMP3 48、72、96 h后，细胞的增殖能力明显增强( P均＜0.05)。实验1组、实验2组、实验3组、实验4组A549细胞48 h后穿过基质胶的细胞数分别为( 104±5)、( 204±8)、( 99± 4)、( 188±7)个，实验1组与实验2组比较，实验3组与实验4组比较，P均＜0.05。结论miR-222基因转染的人非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭能力增强，其可能与miR-222靶向调控TIMP3作用有关。

关键词:微小核糖核酸222;肺肿瘤;非小细胞肺癌;基质金属蛋白酶抑制剂3;细胞增殖;细胞侵袭

Effects of miR-222 gene transfection on proliferation and invasion of human non-small-cell lung cancer cells

LUO Xiang-yu，LUO Wei-min，ZHANG Jun，LIN Chen-yi，GUO Jia-long
( Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China)

Abstract:Objective To investigate the effects of miR-222 gene transfection on proliferation and invasion of human nonsmall-cell lung cancer cells.Methods The qRT-PCR was employed to detect the expression of miR-222 in A549 and 16HBE cells.The miR-222 mimics，scramble，TIMP3-siRNA and si-control sequence were transfected into A549 cells ( experimental group 1，experimental group 2，experimental group 3 and experimental group 4)，respectively.Western blotting was used to detect the expression of TIMP3 protein.The proliferation and invasion abilities were evaluated by MTT and Transwell invasion assay.Results The expression of miR-222 in A549 cells and 16HBE cells was respectively 0.767±0.086 and 0.405±0.034 ( P ＜0.01).The expression levels of TIMP3 protein in the A549 cells of the experimental group 1，experimental group 2，experimental group 3 and experimental group 4 were 0.416±0.023，0.732±0.019，0.430±0.020 and 0.803±0.025，respectively.Significant difference was found between the experimental groups 1 and 2，between the experimental groups 3 and 4 ( all P＜0.05).The cell proliferation ability was increased in A549 cells after overexpressing miR-222 and silencing TIMP3 for 48 h，72 h and 96 h ( all P＜0.05).After 48 h，in the A549 cells，the number of cells through the basement membrane in the experimental group 1，experimental group 2，experimental group 3 and experimental group 4 were 104±5，204±8，99±4 and 188±7，respectively.Significant difference was found between the experimental groups 1 and 2，between the experimental groups 3 and 4 ( all P＜0.05).Conclusion The proliferation and invasion abilities of human non-small-cell lung cancer cells transfected by miR-222 are enhanced which may be related with miR-222 targeted-regulating TIMP3.

Key words:microRNA-222; lung neoplasm; non-small-cell lung cancer; matrix metalloproteinase inhibitor 3; cell proliferation;cell invasion

肿瘤的发生发展过程涉及多种基因的参与和多种因子的调控。miRNA是重要的调控因子，通过调节相关癌基因或抑癌基因，从而参与多种肿瘤的发生、进展过程［1，2］。目前研究者发现的miRNA已有上百种，其中miRNA-222是一个重要的miRNA分子。miRNA-222在多种肿瘤中表达增高，包括乳腺癌［3］、膀胱癌［4］、结肠癌［5］、胶质母细胞瘤［6］以及胰腺癌［7］，提示miRNA-222可能是一个潜在的致癌因子。TIMP3在多种肿瘤中表达下调，并且与肿瘤细胞的增殖与侵袭相关［8，9］。目前对于miRNA-222与TIMP3在肺癌中表达情况及相关作用尚未明确，本研究观察了miR-222基因转染对人非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭的影响。

1　材料与方法

1.1主要材料人支气管上皮细胞16HBE和非小细胞肺癌A549细胞株由中山大学肿瘤防治中心惠赠; RPMI1640培养基购自Hyclone公司(美国) ; MTT粉购自Sigma公司(美国) ; Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司(美国) ; Transwell小室购自BD公司(美国) ; miR-222 mimics(用于过表达miR-222)、scramble(用于miRNA对照)、TIMP3-siRNA(用于沉默TIMP3)与si-control(用于沉默TIMP3对照)序列均由Exiqon公司设计合成; RNA抽提试剂盒购自Applied Biosystems公司; TIMP3和β-actin抗体购自Santa Cruz公司(美国)。

1.2 A549、16HBE细胞miR-222检测采用qRTPCR。用RNA抽提试剂盒抽提16HBE和A549细胞中总RNA，逆转录合成cDNA保存于－80℃冰箱中备用。PCR扩增反应体系为20 μL，其中包括MiR-PCR primers ( 5 mmol/L) 0.4 μL，miRNA RT product 2.0 μL，Taq DNA polymerase 5 U/μL) 0.2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，灭菌蒸馏水7.4 μL。循环体系为95℃3 min，95℃12 s，62℃35 s，72℃30 s，共40个循环。以β-actin为内参，所测定的miR-222的相对表达量采用2－ΔΔCt表示。

1.3 A549细胞miR-222转染方法及分组消化A549细胞，吹打成单细胞悬液并收集离心。倾弃上清培养液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释，制成1×105个细胞/mL的悬液，用250 μL不含血清的培养液稀释100 pmol miRNA 和siRNA，轻轻混匀，室温下孵育5 min;用250 μL不含血清的培养液稀释5 μL的Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5 min，然后将上述两种稀释液轻轻混匀，室温孵育15 min。分别将两者混合液500 μL加入上述不含抗生素和血清的培养孔中，轻轻混匀。分别将miR-222 mimics、scramble、TIMP3-siRNA、si-control转染A549细胞，设为实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。

1.4 A549细胞TIMP3蛋白检测采用Western blotting法。取四组A549细胞，48 h后抽提各组细胞总蛋白，每组取等量样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转膜，封闭1 h，加入DNMT3A抗体或βactin抗体，4℃过夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL发光，X片曝光、显影、定影。

1.5 miR-222基因转染对A549细胞增殖的影响

采用MTT法。取四组A549细胞，将各组细胞接种于96孔板中，设5个复孔，培养至临近饱和，加灭菌MTT液20 μL/孔，继续孵育4 h取出，加入DMSO 150 μL/孔，低速振荡10 min，选择波长570 nm，在酶标仪上测定各孔细胞在24、48、72和96 h的吸光值，并记录。

1.6 miR-222基因转染对A549细胞侵袭的影响

采用Transwell法。在Transwell小室中铺加基质胶稀释液放置过夜成膜。次日取四组A549细胞100 μL稀释液接种至小室的上腔，下腔加500 μL含10%胎牛血清的培养基，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养36 h，取出，擦弃小室上层细胞，4%甲醛固定，0.1%结晶祡染色。光学显微镜下观察并随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值。

1.7统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

miR-222在A549、16HBE细胞的表达分别为0.767±0.086、0.405±0.034，两者比较，P＜0.01。实验1组、实验2组、实验3组、实验4组A549细胞中TIMP3蛋白表达分别为0.416± 0.023、0.732±0.019、0.430±0.020与0.803 ±0.025，实验1组与实验2组比较，实验3组与实验4组比较，P均＜0.05。在A549细胞中miR-222基因转染或沉默TIMP3 48、72、96 h后，细胞的增殖能力增强，详见表1。实验1组、实验2组、实验3组、实验4组A549细胞48 h后穿过基质胶的细胞数分别为( 104±5)、( 204±8)、( 99±4)、( 188±7)个，实验1组与实验2组比较，实验3组与实验4组比较，P均＜0.05。

表1　 miR-222基因转染对A549细胞增殖的影响(±s)

表1　 miR-222基因转染对A549细胞增殖的影响(±s)

注:实验1组与实验2组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;实验3组与实验4组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01。

组别细胞增殖24 h　48 h　72 h　96 h实验1组　0.436±0.025　 0.590±0.047*　0.740±0.042#　0.852±0.065#实验2组　0.419±0.010　 0.485±0.023　 0.569±0.036　 0.636±0.031实验3组　0.423±0.021　 0.600±0.042*　0.746±0.038▲　0.843±0.024▲实验4组　0.418±0.018　 0.501±0.021　 0.580±0.037　 0.645±0.027

3　讨论

非小细胞肺癌包括腺癌和鳞状细胞癌，是肺癌最常见的组织学类型，也是全球癌症相关死亡的主要原因，其5年存活率低，约为13%［10］。miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的非编码、内源性小RNA分子，通过靶向结合mRNA的3'非编码区，使翻译抑制或导致mRNA降解，进而调控靶基因表达量［1］。miRNA参与重要生物学进程的调控，包括细胞增殖、凋亡、分化、代谢等过程。目前，大量的研究者聚焦于肿瘤与表达失调的miRNAs之间关系的研究。研究［11，12］发现miRNA-222在多种肿瘤中有类似癌基因样作用，通过抑制CDK抑制因子p27Kip1 和p57或上调EMT诱导基因ZEB2发挥致癌作用。miR-222在胰腺癌中表达上调，通过下调Ki67促进肿瘤细胞的增殖［4］。miR-222在乳腺癌中表达上调，通过靶向脂联素受体1促进EMT转化［13］。miR-222在卵巢癌和肝癌中表达上调，分别通过靶向其靶基因p27Kip1与p27促进肿瘤细胞的增殖［14，15］。由此可见，miR-222在肿瘤细胞中高表达，可能通过调控细胞的分化、增殖、转移参与肿瘤的发生发展。本研究发现，外源高表达miR-222能明显促进肺癌细胞的增殖与侵袭，提示miR-222在肺癌中具有潜在的促癌作用。

Gan等［16］研究发现，miR-222在乳腺癌中表达上调，TIMP3是miR-222直接调控的靶基因，外源沉默乳腺癌细胞中miR-222的表达可通过上调TIMP3促进乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性。TIMP3是一种前凋亡蛋白，与多种肿瘤细胞的增殖与侵袭相关［8］。研究［8，9］显示，TIMP3在子宫内膜癌以及胃癌中表达下调，并且与患者的临床分期和淋巴结转移相关。本研究发现，在肺癌细胞中外源过表达miR-222能下调TIMP3蛋白的表达，而在肺癌细胞中沉默TIMP3后，肺癌细胞的增殖与侵袭能力也明显增强，进一步提示TIMP3是miR-222下游的功能靶点，miR-222通过下调TIMP3的表达促进肺癌细胞的增殖与侵袭。

综上所述，miR-222基因转染的人非小细胞肺癌细胞增殖与侵袭能力增强，其可能与miR-222靶向调控TIMP3作用有关。miR-222可能是一个潜在的治疗靶点，这为肺癌的防治提供了有用的实验依据。

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收稿日期:( 2015-03-12)

通信作者简介:罗卫民( 1978-)，男，副主任医师，主要研究方向为食管癌、肺癌的诊断及治疗。E-mail: luoweimin0803@ sina.com

作者简介:第一罗湘玉( 1972-)，女，副主任护师，主要研究方向为食管癌、肺癌的诊断及治疗。E-mail: Luoxiangyu2000@126.com

基金项目:湖北省教育厅科学研究计划指导性项目( B2015477)。

文章编号:1002-266X( 2015) 31-0014-03

文献标志码:A

中图分类号:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.005