RNA干扰沉默宫颈鳞癌细胞中HIF-1a基因对survivin基因表达的影响

古力米热·布然江　艾力克木·阿不都玩克　李小文

RNA干扰沉默宫颈鳞癌细胞中HIF-1a基因对survivin基因表达的影响

古力米热·布然江1艾力克木·阿不都玩克2李小文1

【摘要】目的 研究RNA干扰对宫颈鳞癌SiHa细胞中HIF-1α及survivin的抑制效应。方法 使用不同缺氧时间分别缺氧SiHa细胞，以Westernblot法检测细胞中HIF-1a蛋白的表达变化，选择可以引起HIF-1a蛋白表达增加的缺氧培养时间。进行缺氧后用Westernblot法和逆转录聚合酶链反应检测HIF-1α及survivin的表达。结果 SiHa细胞HIF-1α的表达在缺氧处理时较常氧培养时增加，在缺氧后24～48小时内明显升高，60小时略有降低，72～96 h逐渐减少。氯化钴培养后SiHa细胞的HIF-1a蛋白及survivin蛋白表达增加，并与氯化钴浓度有关。通过RNA干扰技术抑制HIF-1a基因的干扰后的细胞中HIF-1a及survivin表达同时减少。结论 在SiHa细胞中，HIF-1α基因和survivin表达具有高度的相关性，并且抑制HIF-1α表达可能通过抑制survivin而促进癌细胞的凋亡。

【关键词】宫颈鳞癌；细胞缺氧；缺氧诱导因子1-α亚基；细胞凋亡

作者单位： 1 830011乌鲁木齐，新疆医科大学附属肿瘤医院妇科放射治疗（二）病区；2 830011乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区人民医院

Effect of RNA Interference Silencing HIF-1a Gene in Cervical Squamous Cell on Carcinoma Cells Survivin Gene Expression

Gulimire·Buranjiang1Ailikemu·Abuduwanke2LI Xiaowen1, 1 Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China, 2 The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital, Urumqi 830011, China

[Abstract]Objective To explore the inhibition effect of RNA interference to HIF-1 alpha and survivin in cervical squamous carcinoma SiHa cells. Methods Deprivate oxygen to SiHa cells in different time, then detecte the changing of HIF-1a protein by Westernblot and choosing the right time which can increase the expression of HIF-1a. Use Westernblot and RT-PCR to detect the expression of HIF - 1 alpha and survivin. Results The HIF-1a expression in SiHa cells was increased by oxygen deprivation, and rised in 24~48 h, decreased a little in 60 h and much more in 72~96 h. The expression of HIF-1a and survivin is related to the concentration of CoCl2, and was decreased by using RNA interference. Conclusion In SiHa cells, the expression of HIF-1a is highly related to survivin so that suppression of HIF-1a could promote apoptosis of cancer cells.

[Key words]Cervical squamous cell carcinoma, Cell hypoxia, HIF-1a, Cell apoptosis

宫颈癌是常见的恶性肿瘤，治疗方式以放化疗为主。肿瘤的放射敏感性与肿瘤细胞是否为乏氧细胞、肿瘤组织中乏氧细胞的比例、是否有放射损伤的修复能力等因素有关[1]。本文使用不同缺氧时间分别缺氧SiHa细胞，以Westernblot法检测细胞中HIF-1a及survivin蛋白的表达，探讨不同条件下RNA干扰对两种蛋白的抑制效应。

1　材料与方法

1.1材料

人宫颈鳞癌SiHa细胞株购自中科院上海细胞所，稳定转染针对HIF-la的shRNA的干扰细胞由本实验室构建保存，羊抗兔二抗购自晶美公司，BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜购自Roche公司，化学发光试剂盒均购自Pierce公司，HRP标记的羊抗鼠二抗购自Rockland公司，其余试剂均为分析纯。

1.2方法

（1）SiHa细胞培养并使其处于乏氧状态。（2）WesternBlot检测HIF-1α基因、survivin基因表达。（3）建议病毒干扰载体，运用脂质体转染的方法，完成干扰基因的表达。（4）RT-PCR方法检测HIF-1α、survivin基因干扰效果，进行基因沉默细胞株的建立及鉴定。

表1　缺氧诱导与基因表达强度量效关系［n=3,（x-±s）］

1.3统计学处理

运用SPSS 17.0统计软件，所得数据以（x-±s）表示，行分组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

乏氧状态下SiHa细胞的HIF-1α及survivin蛋白表达也增加，并与乏氧浓度有关，见表1。选择合适浓度缺氧不同时间，结果显示，细胞常氧时HIF-1α及survivin表达缺氧后24～48小时内明显升高，60小时略有降低，72～96小时逐渐减少。

3　讨论

作为HIF-1唯一的氧调节亚单位，在乏氧条件下，HIF-1α的表达增强，可以与细胞核内乏氧反应元件相结合，上调超过40个其下游基因的表达，包括血管内皮生长因子、转化生长因子等，从而使肿瘤的的血管生成增加、肿瘤细胞的侵袭能力增强、对放化疗的抗拒性增加[2]。通过抑制其表达可以干扰恶性肿瘤细胞的有丝分裂，影响肿瘤细胞增殖。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员，是作用最强的凋亡抑制因子，参与肿瘤细胞缺氧诱导调节过程[3]。

本实验中，HIF-1α表达与缺氧时间有关，但mRNA表达无明显差异，提示缺氧诱导的HIF-1α的调节可能仅发生在蛋白水平。在SiHa细胞中，HIF-1α基因和survivin表达具有高度的相关性，提示抑制HIF-1α表达可能通过抑制survivin而促进癌细胞的凋亡。

参考文献

[1]刘少兵，周祖金，陈森，等. 同步放化疗治疗中晚期宫颈癌[J].肿瘤防治研究，2007，34（3）：204-206.

[2] 景绍武，王雅棣. 缺氧诱导因子-1与肿瘤[J]. 癌变·畸变·突变，2011，23（3）：235-241.

[3] 王婷玉，李俊. 凋亡抑制蛋白的研究进展[J]. 安徽医药，2005，9（6）：402-406.

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目（编号：2012211 A1047）

通讯作者：李小文，E-mail：1538434747@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.25.041

【文章编号】1674-9308（2015）25-0060-02

【文献标识码】B

【中图分类号】R730.2