人类唾液和牙结石中纳米细菌的分离培养及形态观察

韩耀伦　陈红莉　李庆福

人类唾液和牙结石中纳米细菌的分离培养及形态观察

韩耀伦陈红莉李庆福

【摘要】目的从人类牙结石中分离培养纳米细菌，初步探讨纳米细菌和牙周炎之间的关系。方法 取23例牙周炎患者的唾液和牙结石，分离并培养纳米细菌，扫描电镜观察形态。结果 从唾液和结石样本中均观察到了纳米细菌的存在。结论 从牙周炎患者的唾液和牙结石中检出纳米细菌，其与牙周炎的相关性有待进一步探讨。

【关键词】牙周炎； 纳米细菌；扫描电镜

作者单位：450000郑州，河南省人民医院口腔医学中心

Isolation and Culture of Nano-bacteria in Human Saliva and Dental Calculus

HAN Yaolun CHEN Hongli LI Qingfu, Center for oral medicine, He’nan Province People's Hospital, Zhengzhou 450000, China

[Abstract]Objective To study the relationship between bacterial and periodontitis in human dental calculus. Methods 23 patients with periodontitis were isolated and cultured. The morphology of the nanoparticles was observed by scanning electron microscope. Results The presence of nano bacteria was observed in the samples of saliva and stone. Conclusion The correlation between the saliva and dental calculus in patients with periodontitis is a further study.

[Key words]Periodontitis, Nano bacteria, Scanning electron microscope

纳米细菌是一种原核微生物，是一种人畜共患的致病原。国外学者已经在肾结石患者的血液尿液和结石中发现了纳米细菌，纳米细菌的“促成核作用”在结石的形成中起了重要的作用。在中国健康人群的血清中，纳米细菌的感染率为8%[1]。牙周炎是一种慢性感染性疾病，牙菌斑牙结石是重要的局部促进因素。本研究通过对牙周炎患者唾液和结石中纳米细菌的初步分离培养，以期发现纳米细菌存在的证据，报道如下。

1　材料与方法

1.1研究对象

华西口腔医院综合科就诊的牙周炎患者的牙结石和唾液。纳入标准：牙周病，伴或不伴有龋病；牙结石Ⅰ～Ⅲ度；全口余留牙≥20颗；一周内未服用任何抗生素；无严重的系统疾病。符合标准的患者23例，分别取同一患者的牙结石和唾液， -20℃保存备用。

1.2主要试剂和设备

DMEM细胞培养液，胎牛血清，超声清洗机（KQ-50B），低温高速离心机（Z36HK），扫描电镜（FEI INSPECT F），无菌滤器，玻片。

2　实验方法

2.1将唾液样本取出，室温下解冻。高速离心12 000/min，15 min。取上清液，无菌滤器（孔径为0.22 μm）过滤备用。

2.2将结石样本取出，清洗，干燥后研磨为粉末状，加入1 mol/L HCl脱矿30 min，1 mol/L 的NaOH调整溶液的pH值为中性，双蒸水稀释，1 000 g/min离心15 min，取上清液，无菌滤器（孔径为0.22 μm）过滤备用。

2.3盖玻片切割为5 mm×5 mm的小玻片，超声清洗机清洗10 min，烘干，高温高压消毒后备用。

2.4实验分组：取24孔板，每孔内放入无菌小玻片4片，并加入不含胎牛血清的DMEM细胞培养液2 ml，分别加入结石和唾液样本过滤后的上清液100 μl。放入37℃，5%CO2的恒温箱中培养。每7～14 d更换培养液。取出一块玻片，制片后，电子显微镜观察细菌形态。不含血清和样本的DMEM为阴性对照组，DMEM加入10%经热灭活的胎牛血清为阳性对照组。

3　实验结果

见表1。

表1　唾液结石样本中纳米细菌的培养结果

4　讨论

纳米细菌属革兰阴性菌， 用普通光学显微镜难以发现[2]， 在电子显微镜或原子显微镜下观察，呈球状或球杆状，胞壁厚，无荚膜及鞭毛，直径约20～500 nm，可通过0.1～0.4 μm 的滤菌膜。纳米细菌生长过程中能在菌体周围产生坚硬的矿化外壳，形成菌体核心，作为矿化中心参与着牙结石的形成[3]。纳米细菌在矿化的过程中能够升高pH，使环境维持在中性偏碱的条件，以利于牙菌斑的矿化从而形成结石。这种强大的矿化作用让纳米细菌有能力起到矿化中心的作用。

本实验从牙周炎患者的唾液和结石中发现了纳米细菌，扫描电镜下的形态观察和培养特性与文献中所描述的基本一致。现已发明了能对血液中的纳米细菌抗原和抗体进行检测的方法和通过尿液检查的快速检测方法。进一步的免疫学和组织学的检测更能证明纳米细菌的存在。

最近的研究指出，在复发性唾液腺结石中可检测到“纳米细菌”。曾劲峰等从髓石中分离培养、鉴定出“纳米细菌”[4]。临床研究发现，有牙石的患者中龋病的发生显著低于无牙石患者，据此认为：“纳米细菌”可能参与龋坏牙釉质的修复过程，可矿化缺损的牙体组织；因此须权衡“纳米细菌”形成牙石导致牙周病及其在牙釉质修复、龋病预防之间的利弊。

尽管有不少事实证明纳米细菌的存在，但存在分歧。有科学家认为Kajander的结论是污染的结果，是实验设计错误或是分析错误。最近的研究[5]认为“纳米细菌”并非生物体，只是一种蛋白-矿物复合物，最先提出“纳米细菌”概念的Kajander、Ciftcioglu 等也表示，由于缺乏满意的16sRNA 序列，将其命名为钙化纳米颗粒更为恰当；但纳米矿化颗粒与病理性钙化之间的关系仍需进行深入研究和探讨。

参考文献

[1]王学军，刘威，杨竹林，等. 部分健康成年人群血清中纳米细菌感染的调查[J]. 中华流行病学杂志，2004，25（6）：492-494.

[2] 周村，张蕴惠. 牙周病研究进展[J]. 实用医院临床杂志，2007（2）：389-402.

[3]曾劲峰，张伟，蒋宏伟，等. 髓石中Nanobacteria细菌的分离、培养与鉴定[J]. 中华口腔医学杂志，2006（8）：498-501.

[4]王斯玮，杨岚，刘建国，等. 牙周病患者牙结石中纳米级矿化颗粒的分离培养及形态学观察[J]. 遵义医学院学报，2014，37（6）：616-619.

[5]张松梅，田菲，李静，等. 对纳米细菌在牙结石形成过程中的作用的初步研究[J]. 中国微生态学杂志，2009，21（2）：152-155.

·研究分析·

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.24.150

【文章编号】1674-9308（2015）24-0213-02

【文献标识码】B

【中图分类号】R781.4