树突状细胞疫苗对小鼠膀胱癌模型抑瘤效应研究

郭路生　张丽娜　杨宁江

树突状细胞疫苗对小鼠膀胱癌模型抑瘤效应研究

郭路生1张丽娜2杨宁江1

【摘要】目的 探讨负载MB49细胞粗提全抗原的树突状细胞（DC2.4）疫苗对C57BL/6小鼠膀胱癌MB49皮下移植瘤模型的抑瘤效果。方法 制备负载MB49细胞粗提全抗原的DC疫苗；建立小鼠MB49膀胱癌皮下移植瘤模型。造模后第7 d、14 d，疫苗组小鼠于右前腋皮下注射疫苗，PBS对照组相应注射PBS，正常组正常饲养。造模第21 d，测量肿瘤体积和重量。应用免疫组化染色方法检测肿瘤组织内CD4+、CD8+细胞数。应用SPSS13.0统计分析测量数据。结果 DC疫苗组和PBS对照组小鼠肿瘤体积随时间呈现不同程度增长趋势，DC疫苗组缓于PBS对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；造模21 d，DC疫苗组小鼠肿瘤重量小于PBS对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；免疫组化染色检测小鼠肿瘤组织内CD4+、CD8+T细胞数，DC疫苗组CD4+、CD8+T细胞数高于PBS对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 DC2.4树突状细胞疫苗抑制了模型小鼠肿瘤的生长，起到了抗肿瘤的免疫学效应。

【关键词】树突状细胞疫苗；MB49细胞；膀胱癌模型；免疫组织化学染色

作者单位：1 132013吉林，吉林医药学院附属医院；2 132013吉林，吉林医药学院护理学院

基金资助：吉林市科技计划项目（201133103）

Study on Tumor Suppressor Effect of Dendritic Cell Vaccine in Mouse Bladder Cancer Model

GUO Lusheng1ZHANG Li’na2YANG Ningjiang1, 1 The affiliated hospital of Jilin Medical University, Jilin 132013, China, 2 Department of nursing, Jilin Medical University, Jilin 132013, China

[Abstract]Objective To investigate the antitumor effect of dendritic cell vaccine against C57BL/6 cells loaded with MB49 cells in MB49 mice. Methods DC vaccine against MB49 cells were prepared by loading MB49 cells, and the model was established in mice. After making the model, the 7 d, 14 d, the vaccine were injected in right anterior axillary of vaccine group mice, and the mice of PBS control group were injected with PBS, normal feeding to normal group. 21 d after modeling, measurement of the volume and weight of the tumor. The number of CD4+and CD8+

cells in tumor tissues was detected by immunohistochemical staining. SPSS13.0 statistical analysis of measurement data. Results The tumor volume of DC vaccine group and PBS control group showed different degrees of growth trend, DC vaccine group was significantly slower than that in 21 d control group(P<0.01). The tumor weight was significantly less than that in DC group(P<0.01). In tumor tissue of CD4+and CD8+

T cell number and DC vaccine group of CD4+, CD8+

T cell number higher than the PBS control group. The difference was statistically significant(P < 0.01). Conclusion DC2.4 dendritic cell vaccine inhibits tumor growth in mouse model, which has the effect of anti-tumor.[Key words]Dendritic cell vaccine, MB49 cells, Bladder cancer models, Immunohistochemical staining

膀胱癌是泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤，且有逐年增高的趋势；其发病率仅次于前列腺癌，居泌尿系统肿瘤的第二位[1]。膀胱癌也被认为是最有希望通过免疫和基因疗法治疗的疾病[2]。近年来，DC疫苗在实验室中广泛应用于治疗肿瘤的研究，在临床上，也已试验性的应用于肿瘤的治疗[3-4]。本课题探讨DC2.4细胞疫苗在MB49小鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中的抑瘤效应。

1　材料

1.1DC2.4、MB49细胞，受赠于辽宁医学院张佩教授。

1.2C57BL/6近交系雌性小鼠36只，8～12周龄，体重18～20 g，雌性，由上海斯莱克实验动物有限公司提供[许可证编号：SCXK（沪）2012-0005]。

1.3Anti-CD4、Anti-CD8、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP购自北京博奥森生物技术有限公司。

2　方法

2.1小鼠膀胱癌MB49细胞皮下移植瘤模型的建立[5-6]

36只小鼠，按随机数字表法选择其中24只小鼠用于模型建立，另外12只小鼠作为正常对照。取对数期生长的MB49细胞，用PBS调整细胞浓度为5×106/ml。将细胞悬液注射于小鼠右前腋皮下，每只0.2 ml（1×106个细胞）。

2.2DC2.4疫苗接种膀胱癌MB49细胞皮下移植瘤模型小鼠

24只模型小鼠按随机数字表法分为两组：疫苗组和PBS对照组，每组12只。12只正常饲养小鼠作为正常组。收集DC2.4疫苗细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，模型小鼠分别于接种肿瘤细胞后第7 d、14 d给予相应治疗：DC疫苗组给予DC2.4疫苗0.1 ml+PBS 0.1 ml（1×105细胞），PBS对照组给予PBS 0.2 ml，分别注射于小鼠接种肿瘤细胞处的皮下。正常组正常饲养。

2.3肿瘤体积和重量的检测

于造模第7 d、10 d、14 d、17 d、21 d，用卡尺测定肿瘤的长径a和短径b，按V=1/2ab2算出肿瘤体积。造模第21 d，颈椎脱臼法处死各组小鼠，用天秤称量肿瘤质量。

2.4免疫组化染色检测小鼠肿瘤组织浸润CD4+、CD8+细胞数

制备石蜡包埋肿瘤组织切片，采用Envision两步法免疫组化染色。免疫组化图像系统分析组化片，选取炎症坏死区组织，400倍镜下，随机选取15个视野，计数CD4+和CD8+细胞数。

2.5统计学方法

应用SPSS13.0软件进行数据处理和统计学分析，两组间均数比较采用随机分组t检验。

3　实验结果

3.1小鼠肿瘤体积和重量的变化比较

DC疫苗组和PBS对照组小鼠肿瘤体积随时间呈现不同程度增长趋势，DC疫苗组缓于PBS对照组，差异有统计学意义（P ＜0.01）；造模21 d，DC疫苗组小鼠肿瘤重量小于PBS对照组，差异有统计学意义（P＜0.01） ，见表1、图1。

3.2免疫组织化学染色检测小鼠肿瘤组织浸润CD4+、CD8+细胞数

疫苗组CD4+和CD8+T淋巴细胞数均高于PBS对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。各组选取1张免疫组化照片进行比较，见图2。

图1　疫苗组和PBS对照组肿瘤体积变化

图2　PBS对照组与DC组瘤组织CD4+阳性和CD8+阳性细胞表达比较（×400倍）

表1　造模21 d小鼠肿瘤体积和重量测量结果[n=12，

表2　免疫组化检测肿瘤组织CD4+、CD8+细胞数 [n=15，（x-±s），阳性细胞数/400倍镜]

4　讨论

T细胞介导的细胞免疫在机体抗肿瘤效应中起重要作用。参与抗瘤效应的T细胞包括多个亚群，最主要的是T细胞。

DC2.4树突状细胞疫苗激活了疫苗组小鼠体内静息T淋巴细胞，促进了T细胞活化并有大量CD+T细胞增殖，同时促进4CTL成熟及活化。

免疫组化染色结果说明由于DC2.4疫苗的作用，模型小鼠自身免疫系统被激活，疫苗组小鼠体内趋化迁移至肿瘤组织的CD4+、CD8

+T淋巴细胞数显著增多。通过比较各组小鼠肿瘤体积变化和造模后21 d肿瘤质量，初步证明DC2.4疫苗在小鼠MB49膀胱癌皮下移植瘤模型中起到了抑制肿瘤发展的免疫学效应。

参考文献

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doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.24.149

【文章编号】1674-9308（2015）24-0211-02

【文献标识码】B

【中图分类号】R737.1