UPLC-DAD法测定凤冈锌硒茶酒中的咖啡因

马 莹 周胜菊

（贵州省食品药品检验所，550004） (贵州医科大学神奇民族医药学院）

茶酒是以茶叶为主要原料，经过发酵、直接浸提或者过滤勾兑而得的一种具有特殊口味和保健功能的饮料酒，属于保健酒的一个类别。随着国内外茶酒研究逐渐深入，茶酒产品已有20多个品种被开发。以贵州省凤冈县特产有机锌硒茶为原料酿造而成的凤冈锌硒茶酒就是众多茶酒中独具特色的一种。茶与酒经过特殊的工艺操作配制，感官上不仅具有酒的醇柔还保留了茶的清香，风味优雅、口感柔和，且能使其中的营养成分集于一体，所以深受人们关注，并被越来越多的人接受和喜爱，逐渐成为保健酒的一个重要的类别。咖啡因是茶酒的重要品质指标，也是茶酒中的重要安全性指标。目前，茶酒中咖啡因含量测定方法尚未见报道。本文首次建立了凤冈锌硒茶酒中咖啡因含量测定的超高效液相色谱法，可有效监控凤冈锌硒茶酒中咖啡因的含量，也为今后针对茶酒进行的各类质量研究提供实验数据和理论依据。

一、仪器与材料

1.仪器

UPLC-HClass超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XS105DU电子天平（德国METTLER TOLEDO公司）。

2.试剂

甲醇（分析纯：天津市富宇精细化工有限公司；色谱纯：美国Tedia公司）；水（去离子水：实验室自制）。

3.对照品与样品

咖啡因对照品（中国食品药品检定研究院提供，含量100%，批号：171215-201010）；凤冈锌硒茶酒样品（贵州凤冈文土锌硒开发有限公司提供；净含量750mL，酒精度40%Vol，原料为泉水、大米、茶叶、蔗糖、酒曲）。

二、试验方法

1.溶液的制备

（1）对照品溶液的制备。精密称取咖啡因对照品0.01017g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含咖啡因0.5085mg的对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备。取凤冈锌硒茶酒适量，混匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

（3）阴性溶液的制备。取原料含水、大米、蔗糖、酒曲而不含茶的白酒作为阴性样品溶液，取适量，混匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为阴性溶液。

2.色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（美国Waters公司，1.7μm，2.1×100mm，柱号021933135156 06）；流动相：甲醇-水（35∶65）；检测波长272nm，扫描范围190～400nm；流速0.1mL/min；柱温30℃。分别精密吸取制备好的3种溶液各1μL注入UPLC，在上述色谱条件下进行分析，记录色谱峰，计算分离度、理论塔板数等参数，考察系统适应性。

3.方法学考察

（1）线性关系实验。精密称取咖啡因对照品0.01017g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取1、2、3、4、5、6mL，分置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成标准曲线系列溶液。分别精密吸取上述溶液各0.5μL，注入UPLC，记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，咖啡因的量c（μg）为横坐标，绘制线性回归曲线，计算线性方程及相关系数。

（2）仪器精密度试验。精密吸取咖啡因对照品溶液0.5μL，连续重复进样6次，测定峰面积，计算6次峰面积值的RSD。

（3）重复性试验。按照“对照品溶液的制备”方法，制备6份供试品溶液，分别进样0.5μL，测定峰面积，计算样品中咖啡因的含量，并计算含量平均值及RSD。

（4）稳定性试验。取重复性试验中的第1份供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、24h进样共6次，测定咖啡因峰面积，计算6次峰面积值的RSD。

（5）回收率试验。采用加样回收法进行试验。精密称取咖啡因对照品0.02023g，置50mL容量瓶中，加甲醇适量溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为回收率对照品溶液。取凤冈锌硒茶酒适量，混匀，精密吸取9份溶液各5mL，分别置10mL容量瓶中，其中，第1、2、3份分别精密加入咖啡因回收率对照品溶液2mL、第4、5、6份分别精密加入咖啡因回收率对照品溶液2.5mL、第7、8、9份分别精密加入咖啡因回收率对照品溶液3mL，9份试样分别用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔膜滤过，取续滤液注入UPLC进行含量测定，计算咖啡因回收率。

4.样品含量测定

取凤冈锌硒茶酒样品6批，按上述方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别进样0.5μL，记录色谱图，测定峰面积，计算样品中咖啡因的含量。

三、结果

1.系统适应性

在前述色谱条件下，咖啡因与杂质峰分离完全，分离度大于1.5，对照品及供试品色谱中咖啡因峰的理论塔板数均不小于5000（图1～3）。

图1 咖啡因对照品色谱图

图2 供试品溶液色谱图

2.线性关系结果

计算线性回归方程得：A=31550227c-281943，r=0.99997，结果表明在0.05085～0.3051μg范围内，咖啡因的量与峰面积呈良好的线性关系。

3.仪器精密度结果

结果6次峰面积值的RSD=0.64%，表明仪器精密度良好。

4.重复性结果

结果样品含量6次测定值在0.2116～0.2123 mg/mL范围内，平均含量为0.2120mg/mL，RSD=0.13%，表明样品重复性良好。

5.稳定性结果

结果6次峰面积值的RSD=0.15%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

6.回收率结果

该实验的回收率在99.02%～100.33%之间，RSD=0.45%，结果表明用此方法测定咖啡因含量的准确度良好。详见表1。

表1 回收率试验结果

7.样品含量测定结果

按前述方法对6批凤冈锌硒茶酒样品中的咖啡因进行含量测定，结果各批次凤冈锌硒茶酒中咖啡因的含量在0.20～0.26mg/mL范围内，详见表2。

表2 样品含量测定结果 mg/mL

四、讨 论

1.将咖啡因对照标准溶液进行紫外-可见全波段扫描（190～800nm），结果得到咖啡因的2个吸收峰分别处于204.8nm和272.2nm处。为避免溶剂的末端吸收及杂质峰的影响，故选择272nm作为检测波长。大于400nm波长范围咖啡因紫外-可见吸收值为0，故方法中波长扫描范围确定为190～400nm。

2.对流动相比例、流速、柱温进行考察，实验表明在流动相比例为甲醇∶水(体积比)=35∶65、流速为0.1mL/min、柱温为30℃时，出峰保留时间适中，峰型对称，咖啡因峰与杂质峰分离完全，故本方法选定了前述的色谱条件。

3.本研究采用了超高效液相色谱仪（UPLC）建立咖啡因含量测定方法并完成方法学考察。用高效液相色谱仪（HPLC）及HPLC色谱柱对该方法进行了适用性考察。结果所得HPLC图谱中，咖啡因保留时间较长，峰型较差，理论塔板数较低，分离度不理想，今后将继续对该方法进行改进，使之同样适用于HPLC，以便能被更广泛地应用。

4.该方法亦可用于其他各类水基液体样品中咖啡因的检测。当咖啡因作为禁用物质被检测时，如样品色谱中在与咖啡因对照品色谱相应位置处出现色谱峰，应比对该物质的光谱与咖啡因光谱的一致性，进行定性鉴别。

5.经实验得该方法对咖啡因的最低检出浓度为0.4μg/mL。用该方法对菩提子酒、幸九酒、金花茶酒3种原料中含茶的保健酒进行咖啡因的检测，结果均未检出咖啡因。说明原料含茶的酒中并不一定含有咖啡因。含咖啡因与不含咖啡因茶酒品质及功效的差别需进行更深入研究后方能确定。