产油霉菌油脂提取方法的研究

谢莹 霍秋娟 吴彦双 张震 刘爽 吴辰宇

摘要：以产油霉菌雅致小克银汉霉为例进行了前处理及油脂提取方法的研究，采用了酸热法、反复冻融法以及超声波和酶结合法破碎细胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法直接提取油脂。结果表明，超声波和酶结合使用破碎细胞，甲醇-氯仿提取油脂的效果较好；索式抽提法采用石油醚为提取剂效果较好。气相色谱-质谱联用仪分析检测油脂脂肪酸组成为棕榈酸25.10%，油酸25.17%，亚油酸20.99%，硬脂酸4.78%。

关键词：产油霉菌 细胞破碎 提取 油脂得率

中图分类号： Q819 文献标识码：A 文章编号1672-3791（2015）08（b）-0000-00

开发利用微生物进行油脂的生产已经成为当今的一大热点，不但可以作为动植物油脂的必要补充，在促进人类保健方面起着越来越重要的作用，还可以作为生产生物柴油的油源，对解决当今世界各国油脂原料供应问题、促进生物柴油的推广使用、解决环境问题和人类能源问题等都具有重要的意义[1-2]。由于不同种类的微生物细胞壁的结构不同，如霉菌有坚韧 的细胞壁，使我们不能直接获得油脂或者只能获得少量油脂，因此，提取前用前处理方法破坏菌体细胞就显得非常必要[3]。本研究主要以产油霉菌雅致小克银汉霉为例进行了前处理及油脂提取方法的研究，为今后大规模生产微生物油脂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

雅致小克银汉霉菌株：中国工业菌种保藏中心购买。

1.2培养基及主要试剂

（1）PDA固体培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂16 g，蒸馏水1000mL，115 ℃灭菌20 min。

（2）限氮培养基：葡萄糖40 g/L，（NH4）2SO4 1.5 g/L，KNO3 0.5 g，KH2PO4 7 g/L，NaH2PO4 2 g/L，蒸馏水1000 mL，115 ℃灭菌20 min。

（3）各种试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 雅致小克银汉霉菌株的培养

将PDA固体培养基斜面低温保存的雅致小克银汉霉菌株接入到限氮培养基中，于28 ℃，180 r/min的恒温摇床上培养5 d；离心收集菌体，用于油脂提取研究。

1.3.2 油脂提取方法

采用酸热法[4]、反复冻融法[5]以及超声波和酶结合法[6]破碎细胞，甲醇-氯仿提取油脂[7]以及乙醚、石油醚索氏抽提法[8]直接提取油脂。

1.3.3油脂脂肪酸成分分析

称取油脂0.5 g，加1%硫酸-甲醇20 mL与70 ℃水浴加热30 min，加入20 mL正己烷提取甲酯化产物，取出上清，再用10 mL正己烷清洗一次，合并上清，放入瓶中。用GC-MS-2010-plus气相色谱-质谱联用仪检测油脂成分。

2 结果与讨论

2.1 酸热法提取油脂的研究

用不同浓度的盐酸溶液对菌株进行细胞破碎，用甲醇-氯仿溶液萃取，计算油脂得率，结果如图1所示。

图1 盐酸浓度对油脂得率的影响

结果表明，油脂得率与盐酸浓度有关，在一定的浓度范围内，得率随浓度的增加而增加，超过这个范围后，得率随浓度的增加而减小，可能由于盐酸浓度过高，会水解油脂，使收率降低。

2.2 反复冻融法提取油脂的研究

使用冻融法对菌株进行破碎，甲醇-氯仿提取油脂。考察不同冻融次数对油脂提取的影响，结果如图2所示。

图2 冻融次数对油脂得率的影响

随着冻融次数的增加，油脂得率增加，但增加的不明显。此方法破碎细胞，提取的油脂量较低。反复冻融法是通过温度的突然变化，在细胞内形成冰粒， 发生溶胀破碎，由于耗时较长，部分细胞产生了自溶使油脂含量减少。

2.3 超声波与酶结合法提取油脂的研究

先用纤维素酶处理菌体细胞壁，然后改变超声次数破碎菌体，用甲醇-氯仿提取油脂，结果如图3所示。

图3 超声次数对油脂得率的影响

该法采用了酶法和机械法相结合，酶作用后大部分细胞壁裂解，再利用超声波产生独特的机械振动作用使细胞结构发生变化，促使细胞破。结果表明，破碎后测得的油脂含量随超声次数的增加而增大，当达到一定次数时，油脂得率趋于稳定，此方法提取的油脂量与其它方法相比最高，油脂得率达24%。

2.4 索式抽提法

分别以乙醚和石油醚为溶剂，在相同条件下用索式抽提法提取油脂，测得的油脂得率分别为12%和14.8%，表明石油醚的抽提效果较乙醚好。选择石油醚为提取剂，测定不同时间的油脂得率，结果如图4所示。

图4 抽提时间对油脂得率的影响

上图表明抽提时间越长，油脂得率越高，在抽提9 h到10 h时，油脂得率升高明显。

2.5 油脂脂肪酸成分分析

使用GC-MS-2010-plus气相色谱-质谱联用仪检测油脂成分，结果如表1所示。经过分析测定该菌株油脂的成分主要是棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸，与植物脂肪酸的成分相似，可作为生物柴油的原料。

表1 菌株的脂肪酸组成

名称

分子量

脂肪酸组成%

油酸甲酯

296

26.23

棕榈酸甲酯

270

25.45

亚油酸甲酯

294

19.79

硬脂酸甲酯

298

5.67

3 结论

（1）分别研究了酸热法、反复冻融法以及超声波和酶结合法破碎细胞，甲醇-氯仿提取油脂以及乙醚、石油醚索氏抽提法直接提取油脂，将几种方法相比较，结果表明超声波和酶结合使用破碎细胞，甲醇-氯仿提取油脂的效果较好；索式抽提法采用石油醚为提取剂效果较好。

（2）对提取的油脂进行了成分的分析，其中棕榈酸甲酯占25.10%，亚油酸甲酯占20.99%，油酸甲酯占25.17%，硬脂酸甲酯占4.78%，与植物油相似。

参考文献

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