霍山石斛组培苗移栽后微观结构与微区元素的变化研究

*通信作者:方炎明,博士,教授,博士生导师,主要从事植物发育生物学与环境生物学研究。E-mail:jwu4@njfu.com.cn

霍山石斛组培苗移栽后微观结构与微区元素的变化研究

杨静1,2,方炎明2*,陈乃富3

(1 南京林业大学 现代分析测试中心,南京 210037;2 南京林业大学 生物与环境学院,南京 210037;3 皖西学院 生物与制药工程学院,安徽六安 237012)

摘要:采用扫描电镜及X射线能谱仪技术,研究霍山石斛组培苗移栽后各器官组织的微观结构和所含元素的变化,以了解霍山石斛组培苗生长发育以及药效成分的状况。结果表明:(1)霍山石斛组培苗移栽2个月后,根增粗近1倍,具有根被,且根被细胞壁的网络状增厚更加明显,表皮、皮层、中柱发育分化更加完善,Mg、Si、Cl、S、K、Ca元素含量提高,其中 Ca增长了2.76倍。(2)茎表面纵向凹陷增多,内部结构致密,维管束发育较为完善,细胞内充满物质,Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Cu、Zn元素含量增多,尤其是K和Fe分别增长了3.25倍和4.61倍。(3)叶增厚,具有了角质层,气孔形状更加饱满,叶肉细胞内含物丰富,Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Mn、Zn的含量显著上升,其中K升高了17倍。(4)与根、叶相比,茎中所富集的元素种类最多。研究认为,霍山石斛试管苗移栽后,生长发育趋向完善,各项功能增强,细胞内含物质增多,元素成分丰富并且含量提高,体现出对移栽环境的良好适应性。

关键词:霍山石斛;组培苗;移栽;微观结构;元素

收稿日期:2014-10-21;修改稿收到日期:2015-01-12

基金项目:江苏省林业三新工程项目(lysx[2013]07)

作者简介:杨静(1980-),女,博士,讲师,主要从事植物发育生物学与植物电镜技术研究。E-mail:yjnjfu@126.com

中图分类号:Q944.5 文献标志码:A

Changes in Micro-structure and Micro-area Elements of

Post-transplantation Plantlets fromDendrobiumhuoshanense

YANG Jing1,2,FANG Yanming2*,CHEN Naifu3

(1 Advanced Analysis and Testing Center,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;2 College of Biology and the Environment,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;3 College of Biology and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Luan,Anhui 237012,China)

Abstract:Dendrobium huoshanense tissue culture seedlings were transplanted to field environment.In order to get better understanding of thedevelopment and officinal components in the plantlets,we investigated the changes in micro-structure of roots,stems and leaves by SEM after 2 months.The elements in these organs were analyzed by means of Energydispersive Spectrometer.(1)After comparing with tissue culture seedlings,we found robust post-transplantation plantlets with nearlydoubled roughness of roots,the obvious velamina and root cells with significant cellulose network thickening of the velamina cell wall.The structure of epidermis,cortex,and steledeveloped more perfectly,meanwhile the contents of Mg,Si,Cl,S,K and Ca in roots markedly raised,among which Ca grew 2.76 times.(2)Healthy stems were characterized by several features such as conspicuous surface longitudinaldepressions,compact anatomical structure,obviously scattered vascular bundles,and full stem cells with abundant inclusions.The contents of Mg,Si,Cl,S,K,Ca,Fe,Cu and Zn increased significantly,with a 3.25 times increase in K and a 4.61 times increase in Fe.(3)Leaves were found with conspicuous thickening,full stomata,and richer inclusions in mesophyll cells.A significant increase of element contents in leaves was found for Mg,Si,Cl,S,K,Ca,Fe,Mn and Zn,with a 17 times increase in K.(4)More elements were accumulated in stems than in roots and leaves before or after transplanting.In summary,plants grew more perfectly and each function enhanced.Cell content got much richer.More elements in plants and the contents of most elements increased.Those indicated good adaptability of D.huoshanense tissue culture seedlings for the transplanting environment.

Key words:Dendrobiumhuoshanense;tissue culture seedlings;transplantation;micro-structure;element

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)俗名米斛,又称龙头凤尾草,为兰科石斛属(Dendrobium)多年生草本植物,主产于大别山区的安徽霍山[1],具极高的观赏和药用价值,自古以来被认为是药用石斛中的珍品[2-4],享有“中华仙草之最”的美誉[5]。但由于其对生活环境的要求极为苛刻,且自身生长缓慢,加之遭到过度采挖,野生资源濒临灭绝[1,5]。因此,研究霍山石斛资源的可持续开发和利用至关重要。

自20世纪50年代末以来,国内关于霍山石斛的报道很多,主要集中在快繁、资源鉴定、遗传育种、药用成分和药理药效方面[6-18],而电镜下各器官组织的微观结构以及所含元素的定性定量分析极少。本研究拟采用先进的扫描电镜及X射线能谱仪(SEM/EDS)技术,观察霍山石斛试管苗移栽前后各器官组织的微观结构特征,并快速检测选定区域的元素种类以及含量,通过原位分析,一方面掌握其对新环境的适应程度,另一方面了解移栽驯化后药效成分的状况。研究结果不仅为霍山石斛快繁体系的构建提供技术参考,而且为霍山石斛高产并保证药用品种价值提供科学依据。

1材料和方法

1.1　材　料

霍山石斛试管苗取自皖西学院生物与制药工程系石斛组培室,在南京林业大学植物组培室进行培养。移栽前,将完整植株与容器一起转移到半遮荫的自然环境中锻炼5d,然后打开容器口喷洒少量自来水,保持2d之后再移栽。通过筛选,确定组培苗移栽驯化基质为腐树皮加兰花石(2∶1),湿度控制在65%左右。移栽前的组培苗选取部分完整植株以及适量的根、茎、叶材料进行前期样品制备,炼苗2个月后对移栽苗进行取样,方法同上。

1.2　方　法

1.2.1根、茎、叶的微观结构与元素分析每种新鲜材料分别切取5个长×宽×高≤1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的块状样品,装在大小适当的铝盒里迅速投入液氮速冻固定[19],约1.5 min后取出样本立即进行真空冷冻干燥36 h,干燥后的材料,表面经日本HITACHI E1010离子溅射仪喷镀黄金1 min,电流15 mA,使用美国FEI QUANTA200环境扫描电子显微镜观察微观形貌(加速电压15 kV),同时结合英国OXFORD INCA X-Act能谱仪进行微区元素分析,加速电压20 kV,每个试样选取5个不同部位,最终结果取平均值(元素含量用质量百分比表示)。

1.2.2整株材料的元素分析将完整植株自然晾干,研磨成粉末状,经日本HITACHI E1010离子溅射仪喷镀黄金1 min,电流15 mA,使用英国OXFORD INCA X-Act能谱仪进行微区元素分析,加速电压20 kV,分别选取5个不同部位,最终结果取平均值(元素含量用质量百分比表示)。

2结果与分析

2.1　霍山石斛组培苗移栽前后的微观结构观察

形态结构是能够直接反映植株生长状况的重要指标。本试验使用扫描电子显微镜对移栽前试管苗和移栽后植株的根、茎、叶表面与剖面进行了观察分析,结果见图版Ⅰ。

霍山石斛组培苗移栽前(图版Ⅰ,1、2)和移栽后(图版Ⅰ,3、4)根的形态结构上均没有发现根毛结构,移栽后根明显增粗,平均直径达到1 mm左右,而移栽前只有400～500 μm。移栽后根横剖面(图版Ⅰ,4)与移栽前(图版Ⅰ,2)比较,明显可见根被的4～5层细胞,皮层、中柱结构更加清晰,界线较为分明,表明分化发育趋向完善,外皮层细胞壁明显增厚,皮层组织中间的薄壁细胞较大、近圆形,腔内含有一些物质,中柱分布面积较小,初生木质部和初生韧皮部排列较为紧密,而移栽前的横切面未见明显的根被组织。但移栽后根被表皮有破损,清晰呈现出纤维素网络状加厚的细胞壁,而且网络状排列比之前密度加大(图版Ⅰ,5、6)。

霍山石斛试管苗茎的表面发现有纵向凹陷(图版Ⅰ,7),而横切面周缘还比较平滑(图版Ⅰ,8)。炼苗2个月后,茎整体增粗近30%,茎表面的纵向皱褶增多 (图版Ⅰ,9),并且导致圆形横切面的周缘呈陡波状 (图版Ⅰ,10),与移栽前明显不同。试管苗茎横切面的细胞排列(图版Ⅰ,8)较为疏松,基本组织的细胞腔清晰可见,外韧有限维管束散生在基本组织中,呈不规则分布,而移栽驯化后,横切面的结构变得异常致密,基本组织薄壁细胞的内含物丰富,外韧有限维管束散生且数量较多,导管结构完善,并且数量增多(图版Ⅰ,10)。

霍山石斛的叶,气孔只分布于下表皮。叶的下表皮均没有观察到表皮毛结构(图版Ⅰ,11、12)。试管苗的叶(图版Ⅰ,11)不具角质层,气孔微突,大多张开并且开度大,气孔密度为2.48×102/mm2。移栽后叶(图版Ⅰ,12)表皮细胞壁增厚,具有一定的角质化程度,有角质层,表皮细胞呈饱满的卵形,排列整齐,气孔有的张开,有的闭合,并且体积整体比移栽前小,随着叶面积的增大,气孔密度减少为2.07×102/mm2。叶的横切面(图版Ⅰ,13、14)均显示没有海绵组织与栅栏组织的分化,为等面叶。试管苗叶的厚度约为193.49 μm,叶脉维管束已形成,大小不等,相间排列于叶肉中,上表皮细胞柱形,下表皮细胞扁长,整体细胞排列疏松,细胞腔内物质较少(图版Ⅰ,13)。移栽后叶厚度约为292.46 μm,比移栽前增厚51%,叶切面(图版Ⅰ,14)显示上下表皮细胞均近圆形,叶肉细胞排列较紧密,细胞腔内可见较多的絮状物质,细胞内含物质丰富。对气孔进行放大,发现试管苗的气孔整体偏长,保卫细胞肾形,副卫细胞发育不完善(图版Ⅰ,15),移栽苗的气孔器近圆形,保卫细胞和副卫细胞形态饱满,属四列型 (图版Ⅰ,16)。分别对叶的切面结构放大4 000倍,进一步验证试管苗叶肉细胞内含物质较少(图版Ⅰ,17),而移栽后显著增多,并且充满整个细胞腔(图版Ⅰ,18)。总之,微观结构比较发现移栽后的植株结构进一步发育完善,光合功能逐步正常,各项代谢增强,细胞内也就会积累较多的产物。

2.2　霍山石斛移栽前后的元素分析

应用X射线能谱仪(energydispersive spectrometer,EDS)利用特征X射线对霍山石斛试管苗移栽前后完整植株以及根、茎、叶器官组织中某些元素含量进行原位的定性定量分析,具体数据比较见表1。

由表1可知,移栽前后,同类器官组织中同种元素的含量多数存在明显差异。移栽2个月后,根中Mg、Si、Cl、S、K、Ca元素含量显著提高,其中 Ca最明显,增长了2.76倍;茎中Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Cu、Zn元素含量显著增多,尤其是K和Fe,分别增长了3.25倍和4.61倍,Mg、Cl几乎是从无到有;叶中所含元素Mg、Si、Cl、S、K、Ca、Fe、Mn、Zn的含量也上升显著,其中K含量甚至升高了17倍,Fe元素也几乎是从无到有。

表1　元素含量比较(质量百分比)

注:*表示移栽前和移栽后同类器官组织中同种元素的含量在0.05水平上差异显著;字母表示相同时期不同器官组织中同种元素的含量在0.05水平上的差异显著性。

Note:The*indicated significantdifference of element contents in the same organs before and after transplanting at 0.05 level.Thedifferent letters indicated significantdifference of element contents in thedifferent organs in the same period at 0.05 level.

根据表1数据比较显示,大多元素在同时期不同器官组织中的含量也差异显著。对于移栽前的试管苗而言,Na、Si、P、K、Ca、Mn、Fe、Zn元素在茎中的含量都明显偏高,其次是根,另外Cl、Cu元素在根中也比较集中,而叶中Mg、S元素的含量稍高,可能与叶绿素、光合蛋白富集于叶有关。移栽驯化之后,茎中Mg、Si、P、S、K、Ca、Mn、Fe、Zn元素都比根、叶中含量高,其次是叶,此外,叶还富集Cl、Cu元素。

从植株整体的元素含量(表1)来看,移栽后苗中Mg、Si、S、Cl、K、Ca元素含量明显升高,其中K、Ca元素尤为显著,Na、P下降,而微量元素Fe、Zn含量都呈上涨趋势,Mn、Cu元素略有减少。由此可见,霍山石斛试管苗移栽驯化后,如果生长条件合适,将会含有丰富的有益元素并且多数元素还会增多。

总之,移栽后根、茎、叶中多数有益元素含量都明显比移栽前增多,尤其是K、Ca以及微量元素Mn、Fe、Cu、Zn。这些元素成分在一定程度上都有益于人体健康。

3讨论

3.1　霍山石斛组培苗移栽后微观结构适应性变化

组织培养是保存珍贵野生植物资源、实现规模化栽培的重要手段之一,而其中的关键环节是试管苗的脱瓶移栽[20-22]。对于霍山石斛,因对生长环境的要求极为苛刻,移栽后通常会出现苗弱、成活率低的现象,所以如何成功进行移栽至今仍是瓶颈问题,亟待解决[2,13-14]。

试管苗离开养分充足的无菌培养,转移到条件相对比较恶劣的栽培环境,需要一个逐步适应的过程。环境能够塑造植物体的形貌形态和内部结构,所以形貌结构的变化最能直接反映植物的生长发育状态,从而显示出对生长环境的适应情况,只有适应生长环境才能得以繁衍生息[23-25]。本试验发现移栽后,根部最显著的特征是具有明显的根被组织,而移栽前几乎没有。根被由厚壁死细胞组成,细胞壁木栓化,主要起保护、吸水、透气和储藏水分的功能[26],有研究表明附生兰根被细胞的层数和厚度会受环境湿度变化的影响[27]。本试验所取的移栽前组培苗,根可能处于形成发育的早期,并且生长在水分充足的环境中,不具备形成根被的条件,移栽后,一是因为本身的生长发育到了一定阶段,另外,环境湿度的明显减小,也促进根被的形成。同时,移栽后,根被外层部分细胞有破损,明显呈现出纤维素网络状增厚的细胞壁,并且网络状排列密度增大,表明机械强度的增加。根增粗将近1倍,从横剖面还可见细胞更为饱满并且体积增大,表皮、皮层、中柱结构更加清晰,发育状况良好,根被外层部分细胞壁的破损并没有影响正常的生长发育,显示出根被强大的保护作用。此外,移栽后,茎的表面纵沟增多,内部结构变得致密,维管组织发育更加完善,细胞内含物质丰富,为后期成为药用部分奠定基础。组培苗一直生长在营养和水分充足的条件下,自养能力差,输导组织不发达,水分吸收、运输的能力低,出瓶后极易因过度失水而萎蔫甚至导致死亡,本试验中,移栽后,随着叶片的增长,气孔体积却有所减小,也许是植物本能的反应,通过减小气孔器体积降低水分蒸发,避免失水,以逐渐适应当前的新环境。随着结构发育的逐步完善,光合功能增强,代谢增多,叶肉细胞内含物更加丰富,物质的大量累积也表明各项功能的有效进行。

因此,总体来说,移栽苗的微观结构发育趋向完善,植株各项功能日益增强,体现出对环境的良好适应性,表明试验所设置的栽培环境目前还较为合适。

3.2　霍山石斛组培苗移栽后所含元素的状况

石斛具有滋阴清热,益胃润肺、止渴生津等神奇功效,这与其所含有效成分的作用密不可分[3,28]。在中草药药理活性物质的研究过程中,人们发现元素在不同程度上协同发挥抗氧化、抗衰老、提高免疫力等各种疗效[29-30]。EDS可以对除H、He元素以外的所有元素进行定性定量分析,具有简便快捷,准确稳定的优点[31-32]。本试验通过EDS测得霍山石斛含有许多人体必需的元素,并且移栽后,大多元素含量都明显增加,尤其是K、Ca以及微量元素Mn、Fe、Cu、Zn。作为药用部分的茎,所含元素非常丰富,并且Mg、Si、P、S、K、Ca、Mn、Fe、Zn含量明显高于根、叶器官,而Cl、Na、Cu较集中于叶,根含元素种类也较多,这些元素无论对植物本身还是对人体来说都是维持生命的必需元素,因此由本试验的结果来看,根、叶的药用价值也值得关注。据报道,Mg、K还有利于提高氨基酸的含量[33]。Mn、Fe、Cu、Zn是人体必需的微量元素,其中Zn参与多种酶的合成,Mn参与肌体的代谢,Fe是构成血红蛋白、过氧化氢酶的重要成分,也是很多酶的活性部分,尽管在人体内都含量极少,但对维持人体中一些决定性的新陈代谢起着重要作用,一旦缺少就会出现疾病,甚至危及生命,在抗病、防癌、延年益寿等方面的作用不容忽视[34-35]。因此,许多研究者提出微量元素也是中药的有效成分,把中药功效的物质基础分为二大类,一类是生物活性成分,另一类是微量元素,认为药物达到归经部位是通过微量元素向病变部位的迁移、富集和亲和运动来实现的[35-38],可见微量元素的重要性,所以石斛的神奇药效必然有微量元素的功劳。

本试验中,霍山石斛移栽苗的体内富含了多种与药效相关的元素成分,尤其是通常作为药用部分的茎,所含元素非常丰富,但最终能达到的药效程度如何,与野生资源的功效有无差距等,还有待于进一步深入研究。

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Explanation of plate:

Plate ⅠThe microscopic morphology on the root,stem and leaf ofD.huoshanense

xy.Xylem;ph.Phloem

Fig.1.The surface of the root before transplanting;Fig.2.The cross section of the root before transplanting;Fig.3.The surface of the root after transplanting;Fig.4.The cross section of the root after transplanting;Fig.5.The surface cells of the root before transplanting;Fig.6.The surface cells of the root after transplanting;Fig.7.The surface of the stem before transplanting;Fig.8.The cross section of the stem before transplanting;Fig.9.The surface of the stem after transplanting;Fig.10.The cross section of the stem after transplanting;Fig.11.The surface of the leaf before transplanting;Fig.12.The surface of the leaf after transplanting;Fig.13.The cross section of the leaf before transplanting;Fig.14.The cross section of the leaf after transplanting;Fig.15.The stomatal of the leaf before transplanting;Fig.16.The stomatal of the leaf after transplanting;Fig.17.The mesophyll cells before transplanting;Fig.18.The mesophyll cells after transplanting.

图版 Ⅰ霍山石斛根、茎、叶的微观形貌

xy.木质部;ph.韧皮部

1.移栽前根的表面;2.移栽前根的横切面;3.移栽后根的表面;4.移栽后根的横切面;5.移栽前根表皮细胞;6.移栽后根表皮细胞;7.移栽前茎的表面;8.移栽前茎的横切面;9.移栽后茎的表面;10.移栽后茎的横切面;11.移栽前叶的表面;12.移栽后叶的表面;13.移栽前叶的横切面;14.移栽后叶的横切面;15.移栽前叶气孔;16.移栽后叶气孔;17.移栽前叶肉细胞;18.移栽后叶肉细胞。