放疗联合抑制STAT3表达对恶性B细胞免疫原性分子表达的影响

放疗联合抑制STAT3表达对恶性B细胞免疫原性分子表达的影响*

通信作者 E-mail:842031616@qq.com

网络出版时间：2015-10-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20151013.1145.006.html

张启芳1， 禹文峰1， 吴昌学1， 官志忠1， 柏华2**

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学 第三附属医院 医学实验中心， 贵州 都匀558000)

[摘要]目的： 研究放疗联合抑制信号转导与转录激活因子3(STAT3)表达对恶性B细胞免疫原性的影响。方法： 在BALB/c小鼠大腿皮下接种小鼠恶性B细胞淋巴瘤表达GFP的A20细胞形成肿瘤，在肿瘤内注射STAT3基因特异的shRNA质粒并进行放疗；采用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)和免疫印迹法(Western blot)方法分别检测肿瘤组织中STAT3 mRNA和蛋白表达水平；细胞膜蛋白分子染色法检测恶性B细胞表面分子MHCII、CD40和CD80的表达，用流式细胞仪收集细胞染色数据。结果： 放疗联合抑制STAT3表达能显著降低STAT3 mRNA和蛋白表达水平， 与单纯放疗比较，放疗联合抑制STAT3表达治疗显著增加A20细胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。结论： 放疗联合抑制STAT3表达能增强决定恶性B细胞免疫原性的分子表达。

[关键词]信号转导与转录激活因子3； 放射疗法； 淋巴瘤,B细胞； 聚合酶链式反应； 免疫印迹； 流式细胞术

[基金项目]*国家自然科学

[中图分类号]R730.5; R733.4; R34-33[文献标识码] A

The Effect of Combination of Radiotherapy with Abrogating STAT3

Activity on the Maturation of Malignant B-cell Lymphoma Cells

ZHANG Qifang1, YU Wenfeng1, WU Changxue1, GUAN Zhizhong1, BAI Hua2

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Medical

ExperimentalCenter,ThirdAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To examine the effect of combination of radiotherapy with STAT3 inhibition on the immunogenicity of malignant B-cell Lymphoma Cells. Methods: Murine A20 B cell lymphoma cells were subcutaneously injected the thighs of BALB/c mice to form tumors. Tumors were given intratumor injection of STAT3 shRNA plasmid and local radiotherapy. STAT3 expression in tumors was determined by qPCR at mRNA levels and by Western blot at protein levels. The expression of MHCII, CD40 and CD80 were determined by extracellular staining and subsequent data collected by flow cytometry. Results: STAT3 expressions were remarkably silenced in tumors. Compared to radiotherapy alone, radiotherapy combined with STAT3 silencing significantly upregulated the expression of MHCII, CD40 and CD80 on A20 cells.Conclusions: Radiotherapy plus STAT3 silencing increases the expression of molecules that decide the immunogenicity of malignant B cell lymphoma.

[Key words] signal transducer and activator of transcription 3; radiotherapy; lymphoma, B cell; polymerase chain reaction; western blot; flow cytometry

套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)是B细胞非霍奇金淋巴恶性肿瘤的一个独特亚型，约占淋巴瘤的5%~10%。目前治疗淋巴瘤多采用化疗联合妥昔单克隆抗体方案，其次为造血干细胞移植[1-3]。这些治疗虽然可以缓解患者的病情，但多数无法治愈，最终会复发[4-5]。临床急需探寻一种新的治疗方案以提高患者的整体生存率。有研究发现把耐受性抗原呈递细胞转换为能够触发有效的T细胞、反应炎性抗原呈递细胞及增强恶性B细胞的免疫原性，起到抵抗淋巴瘤的作用[6-8]。满足上述要求的治疗策略可能不仅能成功消灭B细胞肿瘤，还可能给机体提供更长久的免疫力，避免肿瘤复发。本研究在BALB/c小鼠大腿皮下接种小鼠恶性B细胞淋巴瘤A20细胞形成肿瘤，利用放疗大量杀死肿瘤细胞，利用免疫原性细胞，诱导机体发生免疫反应，同时抑制信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)表达，探讨放疗联合抑制STAT3表达对恶性B细胞的免疫原性的影响。

1材料与方法

1.1　试剂

小鼠恶性B细胞淋巴瘤A20细胞购自美国ATCC公司 ，STAT3探针购自Universal Probe Library(UPL)，兔抗STAT3(sc-8019)、羊抗β-actin (sc-1616)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(ZB-2301)、兔抗羊二抗 (ZB-2306) 购自美国Santa Cruz公司，荧光标记抗体主要组织相容性复合体(MHC)II、CD40、CD80购自美国eBiosciences，胎牛血清、1x Antibiotic-Antimycotic、1640培养液购自Gibco公司，RNeasy Plus kit 购自Qiagen公司，cDNA合成试剂盒(iScript)购自Bio-Rad公司。

1.2　方法

1.2.1细胞培养及处理把实验前期表达荧光GFP的阳性的A20细胞(A20.GFP)放于含10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培养液，5% CO2的37 ℃培养箱中培养。

1.2.2小鼠带瘤实验 在100 μL 1×PBS中制备含5×106的 A20.GFP细胞悬浮，并接种于BALB小鼠大腿皮下。根据公式V=L×W2/2计算肿瘤体积(V为体积，L为瘤体的长，W为宽)。待瘤块长至约150 mm3时，随机分为3组，每组6只，分别为PBS组、放疗+空质粒组(RT+empty)、放疗+shRNA (RT+shRNA)组，放疗前瘤内注射STAT3基因特异shRNA质粒1次，肿瘤处放疗10 Gy， 放疗当天和第2天按小鼠体质量0.50 mg/(kg·次)瘤内注射质粒。放疗第3天收取肿瘤，切成小块，一部分制备细胞用于染色，一部分用于提取总RNA和蛋白，立即用液氮冻存备用。

1.2.3肿瘤细胞悬浮液制备用手术刀除去肿瘤周边组织，切碎新鲜肿瘤组织，加入collagenase-IV/DNaseⅠ处理，置于含5% CO2的37 ℃培养箱30 min, 加入细胞培养液RPMI，2 000 r/min离心10 min，用RPMI洗细胞一次，计数细胞。

1.2.4STAT3 mRNA表达水平采用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法，采用RNeasy试剂提取细胞总RNA，按iScript反转录试剂盒说明书合成cDNA，用qPCR检测STAT3 mRNA表达水平。用ProbeFinder Version 2.45(Roche)软件设计探针-引物，探针购自Universal Probe Library(UPL)， 人STAT3上游引物序列为5′-CTGCCTAGATCGGCTAGAAAAC-3′，下游引物序列为5′-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3′,内参照TATA-box binding protein(TBP)采用Roche’s Reference Assays。qPCR反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、 60 ℃ 30 s(40个循环)。采集待测基因和内参照TBP的荧光信号值, 计算ΔΔCt及相对含量(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.2.5STAT3 蛋白表达水平采用Western Blot方法，收集细胞，提取总蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF膜上，常规一抗和二抗孵育后， ECL超敏免疫印迹检测试剂 (Amersham公司) 检测蛋白表达，用Image J软件分析图像强度。

1.2.6 细胞膜蛋白染色收集细胞，染色缓冲液漂洗细胞1次，小鼠CD16/32 抗体和小鼠血清封闭细胞膜FcγⅡ/Ⅲ受体，冰上孵育10 min，2 000 r/min离心10 min，加入染色缓冲液稀释的荧光标记抗体，冰上避光孵育30 min。用染色缓冲液清漂洗两次，重悬细胞，用流式细胞仪收集数据，GFP阳性的细胞为肿瘤细胞，用Flowjo软件(treestar)分析数据。

1.3　统计学分析

采用Graphpadprism 6.0自带统计分析软件处理数据，每组实验重复3次，数据均以均数±标准差()表示。多组单变量实验间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计意义。

2结果

2.1　恶性B细胞中STAT3 mRNA和蛋白表达水平

与PBS组和RT+empty组比较， RT+shRNA组STAT3 mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，分别被抑制了50%~60%和50%，说明放疗联合STAT3基因特异的shRNA可以有效地抑制恶性B细胞中STAT3的表达。见图1。

(1)与PBS组比较， P<0.05； (2)与RT+ empty 组比较， P<0.05 图1　恶性B细胞中STAT3 mRNA和蛋白表达水平 Fig.1　Radiotherapy combined with STAT3 shRNA silenced STAT3 expression

2.2　恶性B细胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表达水平

与PBS组和RT+empty组比较， RT+shRNA组MHCH、CD40及CD80平均荧光强度均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，分别增加了46%、40%和60%，说明放疗联合STAT3基因特异的shRNA可以有效增加恶性B细胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表达水平。见图2。

(1)与PBS组比较， P<0.05； (2)与RT+ empty组比较， P<0.05 图2　恶性B细胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表达水平 Fig.2　Radiotherapy combined with STAT3 shRNA upregulated the expressions of MHCII, CD40 and CD80

3讨论

MCL是所有B细胞非霍奇金淋巴瘤中预后较差的肿瘤之一[1-2]。尽管MCL患者对化疗加单克隆抗体的一线治疗初始反应良好，但几乎所有的MCL患者最终都会复发，并对进一步的治疗反应越来越差[1-4]。增强恶性B细胞的免疫原性可产生有效的抗淋巴瘤免疫反应[8]。本研究在BALB/c小鼠大腿皮下接种小鼠恶性B细胞淋巴瘤A20细胞形成肿瘤，利用放疗大量杀死肿瘤细胞和产生免疫原性细胞，诱导机体发生免疫反应，同时抑制STAT3表达，观察恶性B细胞中表面分子MHCII、CD40及CD80的表达水平，结果发现放疗联合抑制STAT3表达有效地上调了MHCII、CD40和CD80在恶性B细胞的表达，增强了恶性B细胞免疫原性。

放疗方法能大量杀死肿瘤细胞，引起免疫原性细胞死亡(Immunogenic Cell Death, ICD)，能诱发机体发生适应性免疫反应，消除远端病灶[9-10]。因此，触发ICD可成为B细胞非霍奇金淋巴瘤新的治疗方案。但是，放疗诱导死亡的细胞也同时释放线粒体DNA、白细胞介素-6(Interleukelin-6, IL-6) 等因子激活STAT3蛋白表达，促进肿瘤生长，引起肿瘤复发[11]。因此，本研究为了规避放疗诱导的死亡细胞激活STAT3蛋白表达，选用特异性shRNA抑制STAT3表达并联合放疗治疗恶性B细胞淋巴瘤，结果显示，放疗联合抑制STAT3表达能显著降低STAT3 mRNA和蛋白表达水平，与单纯放疗比较，放疗联合抑制STAT3表达治疗显著增加A20细胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表达水平(P<0.05)，说明联合治疗增强了恶性B细胞的免疫原性的分子表达。笔者所在研究团队还发现用抑制STAT3表达联合一次大剂量放疗能彻底治愈小鼠B细胞非霍奇金淋巴瘤，3月后没有肿瘤复发；在这些小鼠上又移植了同样的小鼠B细胞非霍奇金淋巴瘤，没有一只小鼠长肿瘤[12]。均说明放疗联合抑制STAT3表达能消除MCL小鼠残留的恶性细胞，避免肿瘤复发，持久增加患者机体持续的免疫潜能。

综上，联合放疗与抑制STAT3基因表达增强了恶性B细胞的MHCII、CD40和CD80的表达，增强了恶性B细胞的免疫原性，促进恶性B细胞成熟。

4参考文献

[1] Chen Y, Wang M, Romaguera J. Current regimens and novel agents for mantle cell lymphoma [J]. Br J Haematol, 2014(1):3-18.

[2] Dreyling M, Amador V, Callana M, et al. Update on the molecular pathogenesis and targeted approaches of mantle cell lymphoma (MCL)- summary of the 12 annual conference of the EUROPEAN MCL NETWORK [J]. Leuk Lymphoma, 2014(4):1-26.

[3] Foran JM, Cunningham D, Coiffier B, et al. Treatment of mantle-cell lymphoma with rituximab (chimeric monoclonal anti-CD20 antibody): analysis of factors associated with response[J]. Ann Oncol, 2000(Suppl 1):117-121.

[4] Williams ME, Dreyling MH, Kahl BS, et al. Mantle cell lymphoma: report of the 2009 mantle cell lymphoma consortium workshop[J]. Leuk Lymphoma, 2010(3):390-398.

[5] Dietrich S, Boumendil A, Finel H, et al. Outcome and prognostic factors in patients with mantle-cell lymphoma relapsing after autologous stem-cell transplantation: a retrospective study of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT)[J]. Ann Oncol, 2014(5):1053-1058.

[6] Sotomayor EM, Borrello I, Rattis FM, et al. Cross-presentation of tumor antigens by bone marrow-derived antigen-presenting cells is the dominant mechanism in the induction of T-cell tolerance during B-cell lymphoma progression[J]. Blood, 2001(4):1070-1077.

[7] Rabinovich GA, Gabrilovich D, Sotomayor EM. Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells [J]. Annu Rev Immunol, 2007(25):267-296.

[8] Cheng F, Wang H, Horna P，et al. Stat3 inhibition augments the immunogenicity of B-cell lymphoma cells, leading to effective antitumor immunity [J]. Cancer Res, 2012(17)：4440-4448.

[9] Galluzzi L, Kepp O, Kroemer G. Immunogenic cell death in radiation therapy [J]. OncoImmunology, 2013(10): 26536.

[10]Vacchelli E, Vitale I, Tartour E, et al. Trial watch: anticancer radioimmunotherapy [J]. Oncoimmunology, 2013(9):25595.

[11]Gao C, Kozlowska A, Nechaev S, et al. TLR9 signaling in the tumor microenvironment initiates cancer recurrence after radiotherapy [J]. Cancer Res, 2012 (17): 4440-4448.

[12]Zhang Q, Hossain DM, Nechaev S, et al. TLR9mediated siRNA delivery for targeting of normal and malignant human hematopoietic cellsinvivo[J].Blood, 2013(8):1304-1315.

(2015-09-02收稿，2015-09-25修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌