干旱对冬小麦叶片气孔、活性氧和光合作用的影响

干旱对冬小麦叶片气孔、活性氧和光合作用的影响

李思，张莉，姚雅琴

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌712100)

摘要：通过盆栽控水方式，以冬小麦小偃22叶片为实验对象，利用生理指标测定、 光合测定和H2DCFDA荧光标记等相结合的方法，研究了4个水分处理下(正常供水CK；轻度亏水LS；中度亏水MS；重度亏水SS)，冬小麦叶片中活性氧含量、丙二醛(MDA)含量、活性氧清除系统的相关保护酶活性及水分胁迫情况下过氧化氢(H2O2)在小麦叶片内的分布情况，同时，还探讨了不同水分胁迫处理对小麦气孔的密度及光合性能指标的影响.结果表明，随着水分胁迫程度的加剧，小麦叶片内H2O2和MDA含量逐渐增加；叶片的气孔密度增加,其中重度胁迫较正常灌溉情况气孔密度增加了44.12%；而光合性能指标(蒸腾速率、光合速率、气孔导度和叶肉细胞间CO2浓度)随水分胁迫的加剧呈下降的趋势. H2O2在叶表皮中的含量随水分胁迫加剧呈增加趋势,且在重度胁迫情况下分布较其他情况更广.本实验为小麦抗旱机理的研究提供了实验依据，为解决旱区农业作物种植问题提供了一定的理论指导.

关键词：小麦；水分胁迫；活性氧；气孔；光合特性

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.05.008

中图分类号：Q945.78；S512.1文献标志码：A

收稿日期:2015-04-17

基金项目：国家自然科学基金资助项目(509073)

Effects of different water stress on active oxygen，stoma and

photosynthesis characteristics of wheat

LI Si，ZHANG Li，YAO Yaqin

(College of Life Science, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Abstract：By means of water control in pot culture, winter wheat (Triticum aestivum L. ) Xiaoyan 22 leaves are used as the experimental material to be tested by methods of physiological indicator detection， photosynthesis measurement and H2DCFDA flourescent dye to figure out the active oxygen amount, malonaldehyde content and distribution of hydrogen peroxide in winter wheat leaves under four water stress conditoins(Control as CK；Light drought stess as LS；Mediate drought stess as MS；Severe drought stess as SS). Meanwhile, the density of winter wheat stoma as well as hydrogen peroxide indexes under water stress has also been explored in this experiment. The results are as follows: with the water stress becoming severer, hydrogen peroxide and malonaldehyde content as well as the density of winter wheat stoma gradually increase, the density of stoma under severe drought conditions shows a rise of 44.12% than that

第一作者：李思(1989-)，女，河北正定人，西北农林科技大学在读硕士研究生，主要从事植物抗旱生理研究.

E-mail：445613242@qq.com

通信作者：姚雅琴(1957-)，女，陕西澄城人，西北农林科技大学教授，主要从事植物逆境生理生态研究.

E-mail：yaoyaqin@nwsuaf.edu.cn

in the control group, while the photosynthetic characteristics (transpiration rate, photosynthetic rate, stomata conductance and CO2concentration within the mesophyll cells ) all indicate a trend of decrease. This study provides an experimental basis for the mechanism of wheat drought resistance, it also provides theoretical guidance for solving the problems in planting crops in arid area.

Key words：winter wheat; water stress; active oxygen; stoma; photosynthetic characteristics

水资源短缺已逐渐成为制约世界作物产量的关键因素[1].因此，对干旱和半干旱地区作物抗旱机理探索，是解决粮食问题的热点研究课题.

随着干旱胁迫的加剧，气孔开度降低，气孔中H2O2的含量急剧上升，表明H2O2在植物控制气孔开度中的作用.由于H2O2有一定的不稳定性且来源和清除途径广泛，少有对在气孔开关过程中H2O2的空间位移和浓度变化的研究.本实验在对小麦干旱胁迫处理逐渐加剧的情况下，进行了对H2O2的荧光染色观察，为H2O2参与气孔运动的理论提供了实验依据.通过盆栽控水方式，以冬小麦小偃22叶片为试材，利用生理指标测定和荧光标记等相结合的方法，研究了4个水分处理下冬小麦叶片中各生理指标随水分胁迫的变化，为小麦抗旱机理的研究提供了实验依据，为解决旱区农业作物种植提供了一定的理论指导.

1材料与方法

1．1　盆栽小麦及控水控肥处理

实验地点选在西北农林科技大学中国旱区研究院内的大棚及温室内，实验区地理气候状况为海拔435～563 m，年降水量635.1～663.9 mm，年均气温12.9 ℃，年均蒸发量1 440 mm，属湿润半湿润大陆季风性气候.实验土壤取自研究院耕地表层0～10 cm 娄土.基本肥力状况：有机质 9.49 g/kg，全氮0.98 g/kg，速效磷25.7 mg/kg. 培栽盆选塑料盆，盆高15.8 cm，入口直径25 cm，桶底部各打4个小孔以保持下层土壤的通气性.为防止塑料盆漏土漏水，4孔之上垫了一层滤纸，每盆装干土4 kg，并拌入尿素1.714 3 g、磷酸二氢钾1.142 9 g.田间最大持水量为24%.

播种时间2013年4月9号，实验小麦种为小偃22.每盆播入经过挑选大小基本一致的饱满小麦籽粒15粒，共12盆，分4个处理，分别为正常(CK)对照、轻度(LS)水分胁迫处理、中度(MS)水分胁迫处理、重度(SS)水分胁迫处理. 如表1所示控水量.播种前，各处理组均灌水对照水平，小麦苗长到三叶期时，苗期处理开始，每天称重确定灌水量，使CK，LS，MS，SS 4个处理保持在相应的水分梯度区段内.处理2周左右，开始取材使用.

表1　控水量

控水量为田间持水量θf的百比分.

1.2　气孔导度、蒸腾速率、光合速率的测定

在天气晴朗的上午，用LI-6400便携式光合测定仪(美国Li-cor公司生产)测定小麦叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度.

1.3　活性氧含量测定

1.3.1H2O2含量的测定

采用硫酸钛沉淀法[22].

采用羟胺氧化法[22].

1.3.3丙二醛(MDA)含量测定

在不同处理下的植株上各称取2～4 g植物叶片，加入少量石英砂和3 mL (分2次加入)质量浓度50 g/L的三氯乙酸溶液(TCA)，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到离心试管中.将研钵用TCA洗净，清洗液移入离心管中，最后用TCA定容至5 mL.在3 000g离心15 min.吸取2 mL的提取液于刻度试管中，加入质量浓度5 g/L的硫代巴比妥酸(TBA)，于沸水浴上加热10 min(自试管内溶液中出现小气泡开始计时)，迅速冷却.于3 000g离心15 min.取上清液以质量浓度5 g/L的硫代巴比妥酸为空白，于450，532，600 nm波长下测定吸光度.计算MDA含量.

1.4　酶活性测量

1.4.1超氧化物岐化酶(SOD)活性测定

用氮蓝四唑(NBT)光还原法[22].

1.4.2过氧化物酶(POD)活性测定

用愈创木酚法[22].

1.4.3过氧化氢酶(CAT)活性测定

用紫外吸收法[22].

1.5　H 2O 2在植物叶片中的定位

荧光探针定位: 分别徒手撕下不同处理小麦叶片下表皮3～5片，放入Mes-KCl负载缓冲液中，加入配置好的含有H2DCFDA的反应液1 μL后避光孵育15~20 min，用Mes-KCl缓冲液漂洗3次，置于载玻片上，在普通荧光显微镜下观察拍照.

1.6　气孔密度和分布的计算与观察

在所选植株向阳面的上、中、下 3个部位各随机选取无病虫、无损伤的样叶一片.采取“印痕法”在叶的背面，避开主脉及边缘，涂上薄而均匀的一层火棉胶，面积大约1 cm2.静置数分钟待干成薄膜，用IM-2D型照度计测量涂火棉胶叶片当时的光照强度，并用干湿温度计测定当时温湿度.将处理过的样叶带回室内观测.取下叶背面的火棉胶薄片用于制片，放在载玻片上，加1滴水，盖上盖玻片，将制成的片子置于光学显微镜40倍物镜下，照相并计算气孔的密度.

1.7　数据处理

用Origin Pro8软件进行数据整理和作图，用SPSS8.0 数据分析软件进行统计分析，采用LSD 法进行差异显著性检验(α=0.05).

2结果与分析

2.1　水分亏缺对小麦叶片光合特性的影响

气孔是植物与外界环境进行物质交换的开关.干旱胁迫对气孔的影响会反映在植物光合作用、蒸腾速率、胞间CO2浓度等生理指标上.利用LI6400便携式光合测定仪对小麦叶片的这些生理指标进行了测定，结果如图1所示.苗期小麦叶片的蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度及其净光合速率，都随着干旱胁迫的加剧呈逐渐下降的趋势.总体而言，在CK和LS情况下，水分处理对上述光合作用的指标作用不显著.而LS和MS以及MS和SS间一般都呈现出了显著性差异.

不同字母表示组间有显著性差异

2.2　水分亏缺对小麦叶片气孔密度的影响

气孔密度会随着环境的变化而出现与之相适应的变化.从图2看出，随着干旱胁迫程度的增加，苗期各处理组气孔密度逐渐增加.与苗期正常对照相比，LS处理增加7.03%，MS和SS处理气孔密度较CK增加较多，分别为36.29%和44.12%.此外还观察到，CK条件下的气孔排列较整齐，呈多列状排列；随着干旱胁迫的加剧，气孔的分布越来越不规律.

不同字母表示组间有显著性差异 图2　水分处理对气孔密度的影响 Fig.2　Effect of treatment on stomatal density

2.3　水分亏缺对小麦叶片过氧化程度的影响

实验结果如图3所示，统计分析发现，水分处理对H2O2、超氧阴离子和MDA含量的影响是显著的.这3种物质都呈现出了随干旱加剧其含量显著上升的趋势. H2O2是生物体内最稳定的活性氧(ROS)分子，因此植物体内H2O2的多少可以反映出植物体内ROS积累情况.超氧阴离子也是一种重要的活性氧自由基，它可以被超氧歧化酶转化为H2O2，因此植物体内超氧阴离子的含量也可以反映出植物体内活性氧的积累情况.如图3所示，苗期轻度(LS)、中度(MS)、重度(SS)干旱胁迫比正常对照(CK)的H2O2含量分别升高了8.91%，38.12%，79.62%.类似地，随着干旱胁迫的加重，苗期玉米叶片中超氧阴离子和MDA的含量也呈增长趋势.

不同字母表示组间有显著性差异

2.4　水分亏缺对小麦叶片保护酶活性的影响

不同字母表示组间有显著性差异

2.5　水分亏缺对小麦叶片气孔中H 2O 2含量和分布的影响

如图5所示，在CK，LS和MS情况下，H2O2集中在表皮气孔中，在其他部位没有分布，且浓度随着干旱胁迫的加剧逐渐上升.在SS情况下，维管束和表皮细胞中的H2O2含量急剧上升，分析认为是胁迫导致的过氧化作用加强所致.

图5　水分处理对H 2O 2分布的影响

3讨论与分析

4结论

本实验通过生理指标检测和化学荧光定位方法，发现小麦通过调节气孔密度、气孔分布和气孔导度等方式来控制水分的散失.随着干旱胁迫的加剧，气孔分布越来越不规律，气孔导度也有所下降.水分胁迫会导致小麦叶片的光合作用降低，体内ROS含量上升，影响植物光合及生长，从而引起叶面积减小，气孔密度增加.与此同时，植物会通过增加合成过氧化物保护酶，降低气孔导度蒸腾速率等响应干旱胁迫的影响. 实验发现，小麦叶片中活性氧主要分布在维管束、气孔的保卫细胞和副卫细胞中，且其浓度随着胁迫的加剧而上升.此研究为研究小麦响应胁迫机理提供了实验支持，为解决旱区农业作物种植提供了理论指导.

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(责任编辑：赵藏赏)