木蝴蝶总黄酮的提取及体外清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究

木蝴蝶总黄酮的提取及体外清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究

刘可心，兰永强，杨娜，陈子燕，张卫

(西北民族大学化工学院， 兰州730124)

摘要：目的 优化木蝴蝶中总黄酮的提取工艺，研究木蝴蝶总黄酮、水提液、精油，清除亚硝酸盐的效果及阻断亚硝胺合成的能力。方法 在单因素实验的基础上，以超声时间、料液比和乙醇体积分数为自变量，以总黄酮提取率为因变量，对自变量各水平进行多元线性回归和二项式拟合，通过响应面曲线法选择较佳工艺；利用紫外分光光度法检测研究木蝴蝶总黄酮、水提液、精油对清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的影响。结果 木蝴蝶总黄酮的较佳提取条件为：料液比1∶53，超声时间119 min，乙醇体积分数45%，木蝴蝶中总黄酮、精油及水提物对亚硝酸钠的最大清除率分别为65.3%，71.2%和42.2%，对亚硝胺合成的最大阻断率分别为58.5%，36.7%和30.9%。结论 木蝴蝶总黄酮对亚硝酸盐的最大清除率略低于精油，但高于大蒜，达到65.3%。同时抑制亚硝化反应的效果高达58.5%，高于精油，其阻断率接近大蒜，清除率和阻断率都高于水提液。木蝴蝶中总黄酮具有较好的清除能力和阻断效果。

关键词：木蝴蝶；总黄酮；响应面分析法；清除率；阻断率

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.004

中图分类号：R284文献标志码：A

基金项目：西北民族大学国家级大学生创业训练项目资助(编号：201410742003)

收稿日期：(2015-05-11)

Extraction of total flavonoids fromOroxylumindicum(L.) Vent and theinvitrostudy on its abilities of scavenging nitrite and the synthetic blocking effect of nitrosamine

LIU Kexin，LAN Yongqiang，YANG Na，CHEN Ziyan，ZHANG Wei(School of Chemical Engineering Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124 ，China)

Abstract:Objective To optimize the extraction process of total flavonoids in Oroxylum indicum，and to study the effect of total flavonoids from Oroxylum indicum on the nitrite savenging and synthesis blocking of nitrosamine. Methods On the basis of single factor，the response surface method was used. UV spectrophotometry was used to study the effect of the water extract and essential oil on the nitrite scavenging and nitrosamine synthesis blocking. Results The optimal extraction conditions of total flavonoids from Oroxylum indicum were as follows: the ratio of material to liquid 1∶53，ultrasonic time 119 min，ethanol concentration 45%. The maximum scavenging rate of sodium nitrite were 65.3%，71.2% and 42.2% respectively，the maximum blocking synthesis of nitrosamine was 58.5%，36.7% and 30.9% respectively. Conclusion The effect of flavonoids on nitrite scavenging was slightly lower than that of essential oil，but higher than that of garlic，reaching up to 65.3%. At the same time，the effect of inhibition of nitrosation was up to 58.5%，higher than that of oil.The blocking rate closed to the garlic.The clearance rate and blocking rate was higher than the water extract. The flavonoids have good effect on scavenging and blocking.

Key words:Oroxylumindicum；general flavone；response surface analysis；clearance rate；blocking rate

木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶Oroxylumindicum(L.) Vent的干燥成熟种子，原名千张纸。木蝴蝶性味苦、甘、凉，入肺、肝、胃经，有清肺、利咽、止咳、舒肝、和胃之功效[1-2]。具有镇痛、抗炎、抗菌、抗氧化、抑制病毒及肿瘤生长等多种药理作用。木蝴蝶中含有黄芩苷、白杨素、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、木蝴蝶定、千层纸苷等多种黄酮类物质[3-4]。目前，国内外对木蝴蝶体外消解亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究未见文献报道。

响应面分析(RSA)法系采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，将多因子实验中因子与指标的相互关系用多项式近似，依次可对函数的响应面和等值线进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系[5]。具有实验次数少、实验精度高等特点[6]。

亚硝酸盐具有致畸、致癌、致甲状腺肿大等危害。大剂量的亚硝酸盐能够引起高铁血红蛋白症，导致组织缺氧，还可使血管扩张、血压降低[7]。成人中毒剂量为0.3～0.5 g，致死量为1～3 g[8]。亚硝酸盐为强氧化剂，进入人体后，可使血中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去运氧的功能，致使组织缺氧，身体出现青紫而中毒。亚硝酸盐是亚硝胺类化合物的前体物质。

亚硝胺是强致癌物，亚硝胺类化合物就是世界公认的强致癌食品污染物。大量动物实验已确认，亚硝胺是强致癌物，并能通过胎盘和乳汁引发后代肿瘤[9]。同时，亚硝胺还有致畸和致突变作用，人群中流行病学调查表明，人类某些癌症，如胃癌、食道癌、肝癌、结肠癌和膀胱癌等可能与亚硝胺有关[10]。因此，研究出清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的有效物质已成为研究防癌防肿瘤药物的重中之重。

本文研究了单因素料液比、超声时间和乙醇体积分数对木蝴蝶总黄酮的提取率的影响，采用了超声提取技术[11]提取总黄酮成分。利用响应面分析法优化了木蝴蝶总黄酮的提取工艺。在此基础上研究了木蝴蝶总黄酮对亚硝酸钠的最大清除率及阻断亚硝胺合成的最佳效果，并与水提液、精油和大蒜做了对比研究，对清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究具有一定的参考价值。

1仪器与试药

1.1仪器紫外-可见分光光度仪(美国热电公司 Analytik jena specord 50)；AB204-S型万分之一电子天平,DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；超声水浴锅(上海科导超声仪器有限公司SK82002H型超声水浴锅)；真空泵。

1.2试药木蝴蝶药材(河北春开制药股份有限公司)；芦丁对照品(上海士锋科技有限公司，20140212)；无水乙醇、亚硝酸钠、无水硫酸钠(分析纯，天津市百世化工有限公司)；硝酸铝、氢氧化钠、二氯甲烷、磷酸氢二钠(分析纯，烟台市双双化工有限公司)；柠檬酸(分析纯，湖南汇虹试剂有限公司)；对氨基苯磺酸(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；盐酸萘乙二胺(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；氨基磺酸铵(分析纯，杭州金菌克生物制品有限公司)；硫酸(分析纯，宜兴市辉煌化学试剂厂)。

2方法与结果

2.1总黄酮提取工艺优化

2.1.1总黄酮提取标准曲线的绘制芦丁标准溶液的配制：精密称定芦丁对照品5 mg ，用体积分数为60%的乙醇定容至50 mL量瓶中，摇匀，静置，得到100 μg·mg-1的芦丁标准溶液[12]。

最大波长的选择：精密量取芦丁标准溶液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入体积分数为60%的乙醇溶液5 mL，摇匀，加入50 g·L-1的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入100 g·L-1的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入1.5 mL氢氧化钠溶液，再加入体积分数为60%的乙醇溶液定容，静置20 min。以空白组做参比，在190～1 100 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，确定最大吸收波长为505 nm。

标准曲线的制作：分别精密量取对照品溶液0,1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL,置于10 mL量瓶中，各加入体积分数60%的乙醇溶液5 mL，摇匀，加入50 g·L-1的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入100 g·L-1的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入1.5 mL氢氧化钠溶液，再加入体积分数为60%的乙醇定容，静置20 min，以空白组做参比，在505 nm波长处测定吸光度[13]。以不同体积的对照品溶液对吸光度进行回归得芦丁标准曲线，标准曲线的相对标准偏差为0.999 7，符合实验标准。

2.1.2木蝴蝶总黄酮提取液的制备精确称量木蝴蝶样品1.0 g,置于烧杯中，加入体积分数60%的乙醇溶液50 mL，在40 ℃水浴下超声100 min。抽滤完全后，将滤液置于100 mL量瓶中，并用体积分数60%的乙醇溶液定容至100 mL。

2.1.3重复性与稳定性实验重复性实验：准确称量5份质量为1.0 g的木蝴蝶粉末，按2.1.2中所述方法制备总黄酮的提取液，分别准确移取2 mL按2.1.1项下所述的方法配置，定容于10 mL量瓶中，在已确定的波长下测其吸光度，计算RSD值。

稳定性实验：准确移取总黄酮提取液2 mL，按2.2.1中所述的方法配置，定容于10 mL量瓶中，在已确定的波长下测其吸光度，每隔10 min测1次，共测5次，计算RSD。

2.1.4单因素实验料液比对总黄酮提取的影响：配制体积分数为60%的乙醇溶液。精密称量木蝴蝶样品1.000 g,5份，分别置于烧杯中，编号1～5，分别加入体积分数60%的乙醇溶液20，30，40，50和60 mL，在40 ℃水浴下超声20 min。抽滤完全后，将滤液置于100 mL量瓶中，加入50 g·L-1的亚硝酸钠溶液3 mL，摇匀，静置6 min，加100 g·L-1氢氧化钠溶液15 mL，摇匀，静置20 min，测其吸光度值[14]。以空白组做参比。

分析料液比对木蝴蝶总黄酮提取率的影响。从实验结果可以得出，料液比为1∶50时，木蝴蝶总黄酮的提取率最高，若料液比继续升高，提取率不再增高，达到了最佳料液比。实验表明，料液比为1∶50时为最佳。

超声时间对总黄酮提取的影响：配制体积分数60%的乙醇溶液。精密称取木蝴蝶样品1.000 g，7份，分别置于烧杯中，编号1～7。加入体积分数60%的乙醇溶液30 mL，在40 ℃水浴下分别依次超声20，40，60，80，120和140 min。抽滤完全后，取滤液置于50 mL量瓶中，加入1.5 mL 50 g·L-1的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入1.5 mL 100 g·L-1的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入7.5 mL 100 g·L-1的氢氧化钠溶液，摇匀，加入乙醇溶液定容至50 mL，静置20 min[14]。以空白组做参比，在505 nm波长下测其吸光度。

分析超声时间对木蝴蝶总黄酮提取率的影响。从实验结果可以得出，超声时间为120 min时，木蝴蝶总黄酮的提取率为峰值，超声时间继续增加，提取率不再增高，达到了最佳超声时间。实验表明，超声时间120 min时为最佳。

不同体积分数的乙醇溶液对总黄酮提取的影响：配制体积分数为30%，40%，50%，60%和70%的乙醇溶液，精密称取木蝴蝶样品1.000 g,5份,分别置于5个50 mL的量瓶中，编号1～5，并向5个量瓶中分别加入上述配制好的乙醇溶液30 mL，在40 ℃水浴中超声20 min，抽滤完全后，取滤液置于50 mL量瓶中，加入1.5 mL 50 g·L-1的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入1.5 mL 100 g·L-1硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，最后加入7.5 mL 100 g·L-1的氢氧化钠溶液，加入各自对应体积分数的乙醇定容至50 mL，静置20 min[14]。以空白组做参比，在505 nm波长下测其吸光度。

分析乙醇的体积分数对木蝴蝶总黄酮提取率的影响。从实验结果可以看出，乙醇溶液的体积分数为50%时，木蝴蝶总黄酮提取率达到最大值，当继续增加乙醇的体积分数时，提取率不再增加，达到了最佳乙醇体积分数。实验表明，乙醇体积分数为50%时为最佳。

2.1.5响应面分析法优化总黄酮提取根据响应面设计原理，结合响应面分析方法，综合单因素实验结果，以乙醇体积分数(X1)、料液比(X2)、超声时间(X3)3个因素为自变量，总黄酮吸光度为响应值，设计3因素5水平共17个实验点(其中14个为析因实验，3个为中心实验)的响应面分析实验[15]。对乙醇体积分数、料液比、超声时间按下列公式进行编码：X1=(X1-50)/10，X2=(X2-50)/20，X3=(X3-120)/20。响应面因素水平编码见表1；响应面分析实验结果见表2；方差分析见表3。

表1响应面因素水平编码

Tab.1 The level coding of response surface factor

项目-10(水平)+1X1,乙醇体积分数/%405060X2,料液比305070X3,超声时间/min100120140

表2响应面分析实验结果

Tab.2 The results of response surface analysis

X1,乙醇体积分数/%X2,料液比X3,超声时间/minR1-10+10.556720000.57923-10-10.566740000.59005+1+100.468260000.57067-1-100.531780+1+10.528890+1-10.546110+10+10.4604110000.596112-1+100.5043130-1+10.435814+1-100.2778150-1-10.3959160000.581417+10-10.3833

表3木蝴蝶中总黄酮吸光度方差分析结果

Tab.3 The results of the orthogonal of variance analysis

来源平方和自由度均方和FPX1X2X3X1X2X1X3X2X3X21X22X23残差失拟项误差总离差模型0.0410.0211.006E-0030.0121.897E-0038.180E-0040.0160.0253.857E-0031.455E-0031.065E-0033.903E-0040.130.131111111117341690.0410.0211.006E-0030.0121.897E-0038.180E-0040.0160.0253.857E-0032.079E-0043.594E-0049.758E-0050.014195.1799.224.8457.059.123.9376.41118.6718.563.64<0.0001<0.0001<0.06380.00010.01940.0887<0.0001<0.00010.00350.1222<0.0001

应用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到乙醇体积分数(X1)、料液比(X2)、超声时间(X3)与木蝴蝶中总黄酮之间的二次多项回归方程：

由表3可知，一次项中乙醇体积分数、料液比对总黄酮吸光度的线性效应极其显著，各因素对总黄酮吸光度的影响大小为X1>X2>X3；二次项中乙醇体积分数、料液比对总黄酮吸光度的线性效应极其显著，料液比对总黄酮吸光度的线性效应高度显著；交互项中乙醇体积分数与料液比、乙醇体积分数与超声时间对总黄酮吸光度的线性效应显著。此外，在本实验设计范围内，回归方程的失拟项检测P=0.103 9>0.05，不显著；回归方程显著性检测P<0.001，极显著，证明应用响应面法优化的提取工艺提取木蝴蝶中总黄酮是可行的。

图1各因素对木蝴蝶中总黄酮得率影响的二维等高线和三维响应面曲线

A.乙醇体积分数和超声时间对总黄酮提取的影响；B.料液比和超声时间对总黄酮提取的影响；C.乙醇体积分数和料液比对总黄酮提取的影响

Fig.1The two-dimensional and three-dimensional response surface contour curves of the total flavonoids yield ofOroxylumindicum(L) Vent factors

A. effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the extraction of total flavonoids；B. effect of feed liquid ratio and ultrasonic time on the extraction of total flavonoids；C. the ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction effect of total flavonoids.

2.2亚硝酸钠的清除及亚硝胺合成的阻断研究

2.2.1亚硝酸钠标准曲线的制作吸取0.4 mL的亚硝酸钠标准溶液(相当于2 μg亚硝酸钠)，置于50 mL量瓶中，各加入pH=3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠2.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4 g·L-1的氨基苯磺酸2 mL混匀，静置3～5 min,各加1 mL 2 g·L-1的盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，静置15 min，测吸光度。确定最大吸收波长为538 nm。

吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0和2.5 mL的亚硝酸钠标准溶液(相当于0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5，10.0和12.5 μg的亚硝酸钠)，分别置于50 mL量瓶中，各加入pH=3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠2.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4 g·L-1的对氨基苯磺酸2 mL混匀，静置3～5 min，各加1 mL 2 g·L-1的盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，静置15 min，测吸光度[16]。以亚硝酸钠标准溶液的体积分数对吸光度回归，得到相对标准偏差为0.999 3，符合实验标准。

2.2.2亚硝酸钠清除率测定-盐酸萘乙二胺法分别吸取5 μg·L-1的亚硝酸钠标准溶液1 mL,置于标号为1，2，3，4和5的50 mL量瓶中，依次加入pH=3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠溶液2 mL，样液2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4.0 g·L-1的对氨基苯磺酸2 mL，混匀，静置3～5 min，加入1.0 mL 2.0 g·L-1的盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，静置15 min，在538 nm处测其吸光度A，平行做3次求平均值，同时做空白对照实验[17]。

亚硝酸盐清除率(%)=(N空-N残)/N空×100%

2.2.3木蝴蝶总黄酮精油、水提液及大蒜醇提物对亚硝酸钠清除率测定木蝴蝶总黄酮、精油、水提液及大蒜醇提物对亚硝酸钠清除率与不同体积的样液之间的关系如图2所示。

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图2总黄酮、水提液、精油和大蒜对亚硝酸盐清除率的折线图

Fig.2The curves of total flavonoids，water extract，essential oil and garlic to nitrite scavenging rate

由图2可知,总黄酮对亚硝酸钠的最大清除率可以达到65.3%。从折线图的走势来看，亚硝酸钠的清除率随样液体积的增加而逐渐增大，达到最大清除率后，清除率逐渐稳定。水提液的清除效果低于总黄酮，精油的清除效果较好。

2.2.4亚硝胺合成阻断率测定分别吸取5 μg·mL-1的亚硝酸钠标准溶液1 mL，置于标为1，2，3，4和5的50 mL量瓶中，依次加入pH为3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠溶液2 mL及样液2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入2.0 g·L-1的氨基磺酸铵1 mL和2.5 mol·L-1的硫酸1 mL终止反应，再用二氯甲烷提取(提取4次)。后用无水硫酸钠(0.1 g∶5 mL)脱水，静置5 min，过滤[18]。在538 nm处测定吸光度A1，平行做3次求平均值，同时做空白对照实验。由于样液颜色的影响，为了减小误差，做了以下实验，即用样液2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL分别加入5.0，6.0，7.0，8.0和9.0 mL的蒸馏水使得测吸光度时样液的浓度一致，测得吸光度A2。结果如图3所示。

亚硝胺阻断率(%)=(A空-A1+A2)/A空×100%

2.2.5木蝴蝶总黄酮精油、水提液及大蒜醇提物亚硝胺合成阻断率测定木蝴蝶总黄酮、精油、水提液及大蒜醇提物对亚硝胺合成阻断率与不同体积的样液之间的关系如图3所示。

图3总黄酮、水提液、精油和大蒜对亚硝胺合成阻断率的折线图

Fig.3The curves of total flavonoids，water extract oil and garlic to nitrosamine synthesis blocking rate

由亚硝胺合成阻断率与不同体积的样液之间的关系(图3)可知,总黄酮对亚硝胺的最大阻断率可以达到58.5%。从折线图的走势来看，亚硝胺的最大阻断率随样液体积的增加而逐渐增大，达到最大阻断率后，阻断率逐渐稳定。水提液的阻断能力低于总黄酮，总黄酮的最大阻断能力接近大蒜。

3结论

实验中通过单因素实验得到了影响总黄酮提取的3个因素，采用响应面分析法进行优化，应用Design-Expert软件，得出了最佳的提取条件为：超声时间为119 min，料液比为1∶53，乙醇体积分数为45%。

由实验结果可知，木蝴蝶中的总黄酮成分对亚硝酸钠的清除率高达65.3%，对亚硝胺的合成阻断率高达58.5%。由此可见，木蝴蝶对亚硝酸钠具有较优的清除能力，并对亚硝胺的合成具有较强的阻断效果。

在体外条件下，比较了木蝴蝶中总黄酮清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的最大值，结果:木蝴蝶总黄酮、水提液、精油和大蒜对亚硝酸盐的清除率分别为65.3%，42.2%，71.2%和41.9%；对亚硝胺合成阻断率分别为58.5%,30.9%,36.7%和64.1%。

在体外条件下，木蝴蝶中总黄酮对亚硝酸盐的清除率略低于精油，但高于大蒜，达到了65.3%。同时抑制亚硝化反应的效果高达58.5%，高于精油，其阻断率接近大蒜，总黄酮的清除效果和阻断能力高于水提液。这表明：体外条件下，木蝴蝶中总黄酮具有较好的清除能力和阻断效果。

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