维药苜蓿子中总多酚与总多糖的含量测定

维药苜蓿子中总多酚与总多糖的含量测定

刘杰1， 张凤雪2， 阿来·赛坎2， 丁文欢3， 田树革3

(新疆医科大学1附属中医医院， 乌鲁木齐830002；2中医学院,3中心实验室, 乌鲁木齐830011)

摘要：目的建立苜蓿子中总多糖与总多酚含量的测定方法。方法以葡萄糖、没食子酸为对照品，以蒽酮-硫酸、福林试剂-碳酸钠溶液体系为显色剂，采用可见分光光度法在检测波长582、760 nm处测定10批苜蓿子中总多糖与总多酚的含量。结果葡萄糖溶液浓度在0.02~0.12 mg/mL、没食子酸溶液浓度为1~7 μg/mL (r=0.999 5)范围内与吸光度呈良好的线性关系，加样回收率为104.30 %、101.46%，RSD为2.40 %、2.90 %,总多糖的含量为22.34~53.43 mg/g，总多酚的含量为3.03~4.88 mg/g。结论可见分光光度法简单，准确性、重复性良好，为苜蓿子多糖与多酚的进一步研究奠定了基础。

关键词：苜蓿子； 总多糖； 总多酚

中图分类号：R914文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.012

[收稿日期：2014-12-01]

基金项目：新疆维吾尔自治区高技术研究发展计划项目(201317102)

作者简介：史银基(1981-)，女，在读硕士，助理研究员，研究方向：药物制剂与新剂型的研究。

Determination of total polyphenols and total polysaccharides in Medicago sativa L.

LIU Jie1, ZHANG Fengxue2, Alai Saikan2, DING Wenhuan3, TIAN Shuge3

(1DepartmentofThePharmaceuticalTheTCMHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830002,China;2CollegeofTCM,3CentralLaboratoryofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a method for content determination of total polysaccharides and polyphenols in Medicago sativa L. seeds. MethodsGlucose and Gallic acid was used as a reference substance, by anthrone sulfuric acid and Folin reagent - sodium carbonate solution system as chromogenic agent； the visible spectrophotometry was used to determine the contents of total polysaccharides and polyphenols in 10 batches of Medicago sativa L. seeds by UV at 582 nm and 760 nm. ResultsThe concentration of glucose in 0.02-0.12 mg/mL and gallic acid in the concentration of 1-7 g/mL (r=0.999 5) showed a good linear relationship between absorbance range. The average recovery was 104.30%, 101.46% with RSD=3.40%, 2.90%, the contents of polysaccharides and polyphenols were 22.34-53.43 mg/g and 3.03-4.88 mg/g. ConclusionThe method is simple, sensitive and accurate, which can offer a basic data for the development research of the Medicago sativa L.

Key words：MedicagosativaL.; total polysaccharides; total polyphenols

苜蓿子是豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的干燥成熟的种子。其为维吾尔医常用的药物之一，载于《药物之园》，维语名叫比地乌拉盖，有润便、理血、通经、催乳、强身、生精的功效；常用于大便秘结、贫血、水肿、闭经、乳汁不通、阳痿、体弱病、关节炎、癞皮病等的治疗[1]。现代研究证明，植物多糖具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化、抗缺氧、抗衰老、抗肿瘤、抗损伤、抗应激作用以及降血糖等[2]。植物多酚中的多元酚结构多具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤以及抗脉硬化等功效，常用于冠心病与中风等心脑血管疾病的防治[3-4]，多糖的测定以葡萄糖为对照品，采用蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸比色法[5-8]，多酚的测定以没食子酸为标准品，采用超声辅助提取，以Folin-Ciocalteu比色法[9]测定苜蓿子多酚的含量。本实验采用可见分光光度法测定10批苜蓿子中总多糖、总多酚的含量，以期为苜蓿子多糖及多酚的开发利用提供基础数据。

1仪器与试药

752S可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，XS-105型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，KQ3200DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。葡萄糖对照品(天津市天新精细化工开发中心，批号：20101024)，没食子酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，含量>98%)，乙醇、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸以及蒽酮等试剂均为分析纯。10批苜蓿子样品采购于各地维吾尔药店，分别为和田6批、喀什3批、加拿大1批，由新疆医科大学中医学院中药资源教研室教师徐海燕鉴定均为豆科植物紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的干燥成熟果实。

2方法与结果

2.1对照品储备液的制备精密称取葡糖糖对照品0.200 0 g，置于100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得葡萄糖对照品储备液。精密称取没食子酸标准品10 mg，置于100 mL的容量瓶中，加入蒸馏水溶解并定容至刻度，即得0.1 mg/mL的没食子酸对照品储备液。

2.2供试品溶液的制备将苜蓿子粉碎，过60目筛，分别称取2 g，置于锥形瓶中，加入50 mL蒸馏水超声提取30 min，过滤，浓缩至30 mL，分别加入30 mL的Sevage试剂(氯仿-正丁3∶1)，振荡30 min以除蛋白，弃去Sevage试液层，加入150 mL 95%乙醇到滤液层，震荡、醇沉过夜，离心，弃去上清液，得苜蓿子多糖，将苜蓿子多糖分别用蒸馏水定容至100 mL，再分别取1 mL稀释至10 mL，即得供试品溶液1。将苜蓿子粉碎，过60目筛，分别称取1 g, 置于锥形瓶中，第1次25 mL 70%(体积分数)超声提取30 min，过滤；第2次加20 mL 70%(体积分数)超声提取30 min，过滤，合并滤液，定容至50 mL，得供试品溶液2。

2.3Folin-Cioealteu试剂的制备分别称取钼酸钠25.0 g、钨酸钠100.0 g，置于圆底烧瓶中加入700 mL蒸馏水溶解，加入50 mL 85%的磷酸和和100 mL的浓盐酸充分混匀，加热回流12 h，放冷，再加入硫酸锂150 g、蒸馏水50 mL以及双氧水0.2 mL，加热至沸腾，保持15 min至亮黄色，直至不带微蓝和绿色，使双氧水完全挥发，冷却，用蒸馏水定容至1 000 mL，过滤，置棕色瓶中避光储存。

2.4标准曲线的测定分别精密吸取葡萄糖对照品储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于6个10 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，再分别吸取1 mL稀释后的对照品溶液置于试管中，各加4 mL硫酸-蒽酮溶液，摇匀，室温放置13 min，置沸水中水浴加热10 min后取出，冷却至室温。于582 nm处测定其吸光度，以葡萄糖对照品溶液浓度(C)为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为A=6.787 C+0.045(r=0.999 6)，结果表明葡萄糖溶液浓度在0.02~0.12 mg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。

精密吸取多酚对照品储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分别置于6个10 mL的干燥具塞比色管中，加入Folin-Cioealteu试剂1 mL，混匀，再加入20 %的碳酸钠溶液2 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，在75℃恒温水浴30 min，于760 nm波长处测定其吸光度值。以没食子酸对照品溶液浓度(C)为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为A=145.28 C +0.032(r=0.999 5)，结果表明没食子酸溶液浓度在1～7 μg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。

2.5重复性试验精密称取同一批苜蓿子样品6份，按供试品溶液的制备方法提取苜蓿子多糖，并按“2.4”项下多糖标准曲线以及多酚标准曲线的测定方法操作，在582 nm和760 nm处分别测定其吸光度值，算得其RSD值分别为2.10 %和1.90 %，表明该方法的重复性较好。

2.6稳定性试验取供试品溶液，分别在0、1、2、4、8 h按测定标准曲线同样的方法操作，测定其吸收度，根据吸光度值计算RSD=1.81%，表明样品溶液在8 h内稳定。

取供试品溶液，分别于配制后的0、30、60、120、180、240 min，按测定标准曲线同样的方法操作，测定其吸收度值，结果表明供试品溶液的吸光度值在30 min内较为稳定，30 min后开始下降，因此供试品溶液在配制完成后应在30 min内测定吸光度。

2.7回收率试验精密称取第一批苜蓿子样品各0.5 g，共6份，分别加入20 mg的葡萄糖对照品，再按供试品溶液的制备方法以及标准曲线的测定方法操作，计算其回收率为104.30%，RSD为2.40%，表明方法的准确性较好。

精密称取第一批苜蓿子样品各0.5 g，共6份，各加入没食子酸对照品4 mg，按供试品溶液的制备方法提取苜蓿子多酚，并按测定多酚标准曲线同样的方法操作，结果加样回收率为101.46 %，RSD为2.90 %，表明该方法的准确性较好。

2.8苜蓿子多糖、多酚含量的测定吸取1 mL的供试品溶液1，按“2.4”项下多糖标准曲线的方法测定吸光度。将吸光度值带入标准曲线方程得到样品溶液中苜蓿子多糖的浓度，并计算其多糖的含量，结果总多糖的含量为22.34~53.43 mg/g，见表1。

吸取0.4 mL的供试品溶液2，按“2.4”项下多酚标准曲线的方法测定吸光度。将吸光度值带入标准曲线方程得到样品溶液中多酚的浓度，并计算其总多酚的含量，结果总多酚的含量为3.03~4.88 mg/g，见表1。

表1　10批苜蓿子中总多糖、总多酚含量结果(n=3)

3讨论

本实验采用水提醇沉法提取苜蓿子多糖，将苜蓿子粉末用水超声提取，过滤、放冷，得提取液，往提取液中加入乙醇使含醇量达到80 %，苜蓿子多糖在醇溶液中溶解度降低而析出。提取液应适当浓缩，以减少乙醇用量，但应控制浓缩程度。浓缩提取液应冷却后再加入乙醇，以免乙醇受热挥发损失。加入乙醇时应慢加快搅，使反应充分。多糖在与硫酸-蒽酮溶液反应显色时放置时间的长短对其吸光度值影响较大，故在测定过程中应尽量保证每个样品的反应时间一致，以降低误差。

植物多酚可溶于水、甲醇、乙醇等极性较强的溶剂，大多选用50%~70%的乙醇提取时，多酚的含量较高，本实验通过对比水提与70%的乙醇提取所得的多酚含量差异，采用70 %的乙醇提取苜蓿子中的多酚，测定苜蓿子中多酚含量时，其稳定性实验结果显示样品在30 min内含量较稳定，而在60 min时以及之后测定的结果显示其多酚含量有所降低，可能与酚羟基的性质有关，因为酚羟基易容易氧化，从而影响实验结果。

本实验采用超声提取法进行苜蓿子多糖、多酚的提取，方法简便易行。采用可见分光光度法测定10个不同批次苜蓿子多糖、多酚含量，结果表明不同批次的苜蓿子多糖、多酚含量有所差异，但10批苜蓿子中多糖的含量均较高，而多酚的含量相对较低。实验结果为苜蓿子多糖、多酚的进一步开发利用提供了基础数据。

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(本文编辑施洋)

通信作者：黄华，女，硕士，研究员，硕士生导师，研究方向：中药药效筛选及评价，E-mail：huangh6505@163.com。