腺病毒36感染对人脂肪源性间充质干细胞PPARγ和adiponectin基因表达的影响

腺病毒36感染对人脂肪源性间充质干细胞PPARγ和adiponectin基因表达的影响

努尔比耶·努尔麦麦提1， 焦谊1， 伊力亚斯·艾萨1， 地力木拉提·艾克热木2，

开色尔·喀米力2， 陆建飞1， 常曦1， 关亚群1

(1新疆医科大学基础医学院生物化学教研室， 乌鲁木齐830011；2新疆维吾尔自治区人民医院， 乌鲁木齐830001)

摘要：目的探讨腺病毒36感染对人脂肪源性间充质干细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)和脂联素(adiponectin)基因表达的影响。方法无菌条件下获取人皮下脂肪组织、I型胶原酶消化并收集人脂肪源性间充质干细胞( human adipose-derived mesenchymal stem cell，hAMSC),细胞传至第3代(P3代)对hAMSC进行定向成脂诱导，并进行油红O染色；流式细胞仪检测hAMSC表面免疫表型；人类腺病毒36 (adenouirus-36,Ad36 )感染hAMSC，采用荧光实时定量PCR(Real time-PCR)方法检测Ad36感染的hAMSC PPARγ和adiponectin基因表达的变化规律。结果(1)hAMSC在体外呈梭形生长，且能稳定传代；(2)细胞在加入成脂诱导剂后可定向分化成脂肪细胞；(3)流式细胞术检测结果显示hAMSC免疫表型：CD105 (93.0±1.3)%，CD44 (99.6±0.3)%，CD34(0.2±0.1)%，CD45(0.2±0.3)%，CD31(0.3±0.3)%， CD29(3.4±0.2)%；(4) Ad36感染hAMSC后细胞内脂滴逐渐增多、增大。 PPARγ和adiponectin基因在Ad36感染hAMSC后的第1天开始表达，感染后第2~6天较0 MOI组显著升高(P<0.05),至感染后第8天10 MOI剂量组表达水平开始下降。结论Ad36使hAMSC定向分化成脂肪细胞，并上调了PPARγ和adiponectin基因的表达。

关键词：人脂肪源性间充质干细胞； 腺病毒36； PPARγ； adiponectin

中图分类号：R: 34文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.009

[收稿日期：2014-11-17]

基金项目：国家自然科学基金(81060021)

作者简介：包馨慧(1989-)，女，在读硕士，研究方向：心血管疾病基础与临床研究。

The variation of PPARγ and adiponectin genes expression in adenouirus-36

infected human adipose-derived mesenchymal stem cell

Nuerbiye Nuermaimaiti1， JIAO Yi1， Yiliyasi Aisa1， Dilimulati Aikeremu2， Kaiseer Kamili2，

LU Jianfei1， CHANG Xi1， GUAN Yaqun1

(1DepartmentofBiochemistry，PreclinicalMedicineCollege，XinjiangMedicalUniversity，

Urumqi830011,China；2XinjiangUygurAutonomousRegionalPeople’sHospital，Urumqi830001,China)

Abstract:ObjectiveThe objective of this study was to investigate the variation of PPARγ and adiponectin gene expression in adenouirus-36 infected human adipose-derived mesenchymal. MethodsWe isolated adipose-tissue from a patient under sterile condition, collected human adipose-derived mesenchymal stem cell (hAMSC) with collagenase I， cultivated cells till passage 3 to differentiate into adipogenic cells. The immune phenotype were examined under flow cytometry. The expression of PPARγ and adiponectin genes were determined in Ad36 infected hAMSC. Results(1) hAMSC grew spindle-shaped in vitro and passaged stably; (2) hAMSC differentiated into adipogenic cells after cultivated with adipogenic inducer；(3) The results of flow cytometry: CD105 (93±1.25)%, CD44 (99.6±0.3)%, CD34(0.2±0.06)%, CD45(0.2±0.25)%, CD31 (0.3±0.25)%, CD29(3.4±0.2)%. (4) Ad36 induced lipid accumulation in hAMSC, and the expression of PPARγ and adiponectin increased gradually in hAMSC and reached highest level at 6 day′s post infection. ConclusionAd36 induced lipid accumulation and upregulated PPARγ and adiponectin genes.

Key words: human adipose-derived mesenchymal stem cell； adenouirus-36； PPARγ； adiponectin

肥胖症是指体内脂肪堆积过多或分布异常、体质量增加的一种多因素慢性代谢性疾病。无论是在发达国家还是发展中国家，目前肥胖都是广泛流行的多因性代谢疾病[1]。肥胖能引起机体代谢紊乱，导致许多疾病的发生，影响人的健康及寿命，已成为一个世界范围内的社会和健康问题[2]。美国科学家Dhurandhar等[3]研究发现，肥胖的发生与人类腺病毒36型(adenouirus-36，Ad36)感染有关。Ad36感染小鼠后，增加脂肪细胞的脂质聚集和胰岛素敏感性，其功能与噻唑烷二酮类(Thiazolidinediones，TZDs)药物相似[4]。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)主要表达于脂肪组织，与脂肪细胞分化及胰岛素抵抗关系密切。脂联素(adiponectin)是脂肪细胞特异分泌的细胞因子，具有增加胰岛素敏感性和调节糖、脂代谢的作用。本研究选取人脂肪源性间充质干细胞，检测 Ad36感染对hAMSC PPARγ和adiponectin基因表达水平的影响，旨在探讨PPARγ和adiponectin基因与Ad36引起的肥胖间的关系。

1材料与方法

1.1研究对象收集人脂肪源性间充质干细胞(hAMSC)，细胞取自就诊于新疆维吾尔自治区人民医院骨科择期手术患者，男性，31岁，维吾尔族，BMI 22.6 kg/m2。无急性炎症、肿瘤及其他内分泌疾病和各种传染性疾病。本研究已通过伦理委员会审核。

1.2hAMSC的培养和传代手术中无菌条件下取1块脂肪组织，于含1 000 U/mL 青/链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡15 min后，用PBS反复冲洗3次至液体澄清为止，用眼科剪将脂肪组织剪成糊状，根据脂肪组织的体积按1∶1比例置于1 mg/mL的Ⅰ型胶原酶中，37℃水浴中震荡消化约30 min，直至悬液成糊状，加20 mL PBS稀释消化液，2 600 r/min离心10 min 后弃油脂和上清，加入含10%胎牛血清(Hyclone公司)的低糖-DMEM培养液重悬，制成单细胞悬液，接种于10 cm平皿中，置37℃、5% CO2培养箱中培养48 h后换液，以后2 d换液1次。细胞汇合达到80%时消化传代。

1.3hAMSC的成脂诱导取第4代细胞汇合达到80%后加入成脂诱导剂(含FBS、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛)，3 d换1次液，分别于诱导后第3、5、7、9天进行油红O染色。

1.4流式细胞仪检测hAMSC免疫表型取第4代细胞，用Trypsin-EDTA(Gibco 公司)消化后，PBS洗2遍，制成单细胞悬液，设阴性对照和同型对照组，分别加单克隆抗体CD29-PE、CD44-FITC、CD105-PE、CD31-FITC、CD34-PE、CD45-FITC，于4℃避光孵育30 min,PBS洗3遍，洗掉多余的抗体后进行流式细胞仪(Beckman 公司)检测。

1.5腺病毒36感染取第5代细胞汇合达到80%后饥饿处理(不含FBS的低糖-DMEM)过夜(12 h)，细胞分别用0、2.5、5、10、30病毒接种量(MOI)， 置37℃、5% CO2培养箱中培养1 h,换含10%FBS、1%双抗的低糖-DMEM培养液，置37℃、5% CO2培养箱继续培养。病毒感染后第4天进行油红O染色。检测Ad36标记基因E1A，鉴定Ad36是否感染成功。

1.6hAMSC总RNA的提取不同剂量的病毒感染hAMSC细胞后的第1、2、4、6、8天用经典Trizol法提取hAMSC细胞的总RNA，应用 Gene Quant 核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。

1.7PPARγ、adiponectin、E1A 基因 mRNA表达的检测引物设计与合成： 应用primer 5.0 设计人PPARγ、adiponectin、E1A与内参照β-actin的引物，由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1　RT-PCR引物序列

2结果

2.1hAMSC的形态学特征原代细胞培养2 d后，显微镜下可见细胞呈短梭形，贴壁生长(图1)。原代细胞传3代后，细胞呈形态大小一致的细小梭形，贴壁生长(图2)。

图1　原代P0代细胞(×100)

2.2hAMSC的定向成脂诱导成脂诱导的细胞培养3 d后，镜下可见透明脂滴出现，随着培养时间延长，脂滴逐渐增多并有汇集现象。分别对第3、5、7、9天的细胞进行油红O染色，出现红色提示为脂肪细胞(图3)。

2.3hAMSC的流式细胞术检测流式细胞术检测hAMSC细胞免疫表型结果: CD31 (0.3±0.3)%，CD105 (93.0±1.3)%，CD44 (99.6±0.3)%，CD34(0.2±0.06)%，CD45(0.2±0.3)%，CD29(3.4±0.2)%(图4)。

图2　原代P3代细胞(×50)

A: 诱导分化第3天(×200)B: 诱导分化第5天(×200)C: 诱导分化第7天(×200)D: 诱导分化第9天(×200)

图3油红O染色

A: CD105-PEB: CD31-FITCC: CD44-FITC

D: CD45-FITCE: CD34-PEf: CD29-PE

图4流式细胞术检测hAMSC细胞免疫表型结果

2.4Ad36感染对hAMSC细胞的影响

2.4.1Ad36标记基因E1A的表达Ad36的标记基因E1A在对照组未表达，在Ad36感染组表达，说明Ad36成功感染hAMSC(图5)。

2.4.2Ad36感染对hAMSC细胞形态的影响分别用5、10、30 MOI Ad36病毒感染hAMSC细胞2 d后，镜下可见透明脂滴出现，随着剂量和时间增加，脂滴逐渐增多，至第6天30 MOI感染的细胞出现脱脂和细胞脱落的现象。感染后的第4天，分别对3种不同剂量病毒感染的hAMSC细胞进行油红O染色，出现红色为阳性(图6)。

A: E1A扩增曲线　　　　B: E1A溶解曲线

A: 5 MOI Ad36感染后第4天B: 10 MOI Ad36感染后第4天C: 30 MOI Ad36感染后第4天

图6油红O染色

图7　Ad36感染对hAMSC细胞PPARγ mRNA表达水平的影响

表2　Ad36感染对hAMSC细胞PPARγ mRNA表达水平的影响( ±s)

注：与0 MOI组比较，*P<0.05。

2.4.4Ad36感染对hAMSC细胞adiponectin基因表达的影响与0 MOI组比较，Ad36感染后第1天， adiponectin基因在30 MOI剂量组中表达水平显著升高(P<0.05)。第2天，10、30 MOI剂量组表达水平显著升高(P<0.05)。第4天，10 MOI剂量组表达水平显著升高(P<0.05)。第6天，2.5、5、10 MOI剂量组表达水平显著升高(P<0.05)。第8天，2.5、5、10 MOI剂量组表达水平升高但差异无统计学意义(表3，图8)。

图8　Ad36感染对hAMSC细胞adiponectin mRNA表达水平的影响

3讨论

肥胖是世界范围内广泛流行的健康问题之一，是导致心脑血管疾病的高危因素，其增加了糖尿病、高血压、高脂血症等多种疾病的发病率，是危害人类健康最严重的疾病之一[1]。因此，肥胖发生机制的研究得到了越来越多国内外研究者的关注。导致肥胖的原因很多，包括遗传因素、摄食行为、环境和心理因素等。肥胖的发生与人类腺病毒36型感染有关[3]。Ad36与人类肥胖以及Ad36与鼠、鸡、猕猴、小猿和兔子等动物肥胖的关系已被证实[3]。Atkinson等[5]对威斯康星、佛罗里达及纽约的502名受试者进行研究发现，其中肥胖人群的Ad36感染率为30%，而非肥胖人群的Ad36感染率只有11%，并且感染Ad36和未感染Ad36的人群相比其体质量升高，血脂却降低。另外，本课题组前期的研究发现，维吾尔族肥胖患者Ad36感染率明显高于非肥胖组，感染Ad36的肥胖患者表现出血糖、血脂降低等特点[6]。研究发现，Ad36感染能够促进大鼠脂肪的形成并改善胰岛素敏感性，其作用类似于噻唑烷二酮[7]，并且Ad36 的E4orf1基因被认为是导致啮齿类动物和人脂肪细胞分化的诱导剂[8]。另外，人骨骼肌细胞和人骨髓间充质干细胞中，E4orf1通过使葡萄糖转运蛋白4的表达上调来增加细胞的糖摄取[8]。尽管如此，目前Ad36导致肥胖的细胞和分子机制尚不清楚。而Ad36与人类肥胖关系研究中缺少适当的模型正是如今所面临的问题之一。

表3　Ad36感染对hAMSC细胞adiponectin mRNA表达水平的影响

注：与0 MOI组比较，*P<0.05。

Pasarica等[9]使用3T3-L1前脂肪细胞作为细胞模型。然而3T3-L1前脂肪细胞已经定向成脂肪细胞，在增殖、分化、功能方面都有一定的局限性。而且3T3-L1前脂肪细胞是小鼠胚胎成纤维细胞，用小鼠胚胎成纤维细胞展开人类基因方面的研究会有一定的局限性。基于3T3-L1模型用于人类研究的局限性和人类在体试验的困难，有必要构建Ad36感染的人类脂肪细胞模型。本研究选用的人脂肪源性间充质干细胞(hAMSC)，是具有多向分化能力的细胞，可以定向分化成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞，其增殖、分化能力也比较强。由于hAMSC具有获取容易、获得量大、对机体损伤少等优点，使其成为当前干细胞领域研究的热点。本研究对hAMSC的生物学特性及增殖特点进行阐述，从hAMSC的形态学特点、定向成脂分化能力、流式细胞仪检测免疫表型3个方面证明本研究成功获得hAMSC。本研究使用成脂诱导剂将hAMSC定向分化成了成熟的脂肪细胞。Ad36感染hAMSC后能表达Ad36标志基因E1A，Ad36能成功感染hAMSC。而且Ad36感染hAMSC后在未添加成脂诱导剂的条件下能使hAMSC诱导分化成脂肪细胞，改变hAMSC中的基因表达，为后续Ad36感染人类脂肪细胞的研究提供了合适的细胞模型。

PPARγ属核受体超家族成员，是调节脂肪细胞分化的重要因子；PPARγ又是胰岛素增敏剂-噻唑烷二酮类药物(TZDs)作用的靶分子，TZDs与其结合后，调控与胰岛素效应有关的多种基因的转录，从而发挥TZDs降血糖、降血脂以及增加外周组织的胰岛素敏感性等作用，因此PPARγ与脂肪细胞分化、肥胖、高脂蛋白血症、2型糖尿病等关系密切[10]。Adiponectin是脂肪细胞特异分泌的细胞因子，具有增强胰岛素敏感性和调节糖类、脂质代谢的作用，可改善高胰岛素血症和胰岛素抵抗。有研究发现，在肥胖、2型糖尿病及心血管疾病患者中，通常伴有胰岛素抵抗和高胰岛素血症，其血浆adiponectin水平均有下降[11]。肥胖患者血浆adiponectin降低与胰岛素抵抗及高胰岛素血症有关。Adiponectin是连接肥胖与胰岛素抵抗、高胰岛素血症、2型糖尿病的一种介质[12]。本课题组前期的研究发现，维吾尔族肥胖患者血浆adiponectin水平下降，而感染Ad36 的肥胖患者与非感染36的肥胖患者比较，血浆adiponectin水平显著升高并伴有血脂、血糖水平降低等特点。维吾尔族肥胖患者与非肥胖患者中PPARγ表达水平没有差异，而感染Ad36的肥胖患者与非感染36的肥胖患者比较，PPARγ表达水平显著升高。提示，Ad36感染可能调节了维吾尔族肥胖患者PPARγ和adiponectin表达水平的变化，2个细胞因子可能均与Ad36引起的肥胖相关，但机制尚待阐明。

本研究结果显示， Ad36感染hAMSC后的第2天细胞内开始出现透明脂滴，到第6天，90%视野内的细胞都出现脂滴，而未感染Ad36的对照组始终没有出现脂滴。说明，Ad36可以增加hAMSC脂质聚集，使hAMSC定向分化成脂肪细胞。另外，感染Ad36的hAMSC较未感染Ad36的hAMSC其PPARγ表达水平显著升高。PPARγ是调节脂肪细胞分化的重要因子，这与Ad36增加hAMSC脂质聚集，使hAMSC定向分化成脂肪细胞的结果一致。提示，Ad36可能通过上调PPARγ表达水平，进一步调控其下游基因的转录，最终实现hAMSC的定向分化。Adiponectin能增强胰岛素敏感性，调节糖类、脂质代谢，但肥胖和2型糖尿病患者其表达水平降低[12-13]。本研究结果发现，感染Ad36的hAMSC与未感染Ad36的hAMSC比较，adiponectin表达水平显著升高，与本课题组在人类研究中血浆adiponectin的表达变化一致，提示Ad36可能通过上调adiponectin表达而最终发挥增加胰岛素敏感性、改善高血糖症等作用。但这其中的作用机制目前尚不清楚。

综上所述，Ad36使hAMSC定向分化成脂肪细胞，并上调了PPARγ和adiponectin基因的表达。

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三是水工程建设和管理仍相对滞后。尽管我国已初步形成了蓄引提调相结合的水资源配置格局和基于大江大河干流的防洪减灾体系，但洪灾水患问题和工程性缺水仍普遍存在，水利投入仍存在较大缺口。农田水利、中小河流治理、农村饮水安全工程、小型水库病险率高等问题突出，亟待加强专项治理。

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(本文编辑周芳)

通信作者：李晓梅, 女，博士，副主任医师，副教授，研究方向：冠脉介入的基础及临床研究，E-mail: Lixm505@163.com。