不同证候噎膈患者血清调控食管癌EC9706细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路差异分析

·中医·中西医结合研究·

不同证候噎膈患者血清调控食管癌EC9706细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路差异分析

贾永森，林清，秦丽娟，张艳丽，刘春秋，江春花，闫昕，曹慧娟

作者单位：063000 河北省唐山市，华北理工大学中医学院(贾永森，林清，江春花，闫昕，曹慧娟)；华北理工大学基础医学院(秦丽娟)；迁安燕山医院(张艳丽)；唐山市人民医院(刘春秋)

通信作者：秦丽娟，063000 河北省唐山市，华北理工大学基础医学院；E-mail：qinlj20012003@163.com

【摘要】目的通过研究噎膈血瘀证、脾气虚证患者及健康人血清对食管癌EC9706细胞增殖、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子kappaB(NF-κB)信号通路相关分子mRNA及蛋白表达的调控，探讨噎膈血瘀证、脾气虚证的分子机制。方法本研究于2014年6—12月选择来源于唐山市人民医院、迁安燕山医院肿瘤内科的病理确诊的食管鳞癌患者。按照《中华人民共和国中医药行业标准——中医病症诊断疗效标准》确定噎膈血瘀证或脾气虚证标准，选取血瘀证、脾气虚证患者各10人，另选取健康志愿者10人(来自两院体检人员)。将EC9706细胞于37 ℃，5%饱和湿度的二氧化碳(CO2)培养箱孵育24 h，饥饿24 h，分别加入倍比梯度的噎膈血瘀证、脾气虚证患者和健康人血清，噻唑蓝(MTT)染色法检测细胞增殖变化；实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测PI3K、Akt、NF-kB表达；免疫印迹(Western blot)法检测PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关分子蛋白表达。结果血瘀证患者血清刺激细胞的50%增殖率为71.1 μl/ml，脾气虚证为118.0 μl/ml；血瘀证患者血清上调细胞PI3K、Akt和NF-κB mRNA表达水平，与各对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，脾气虚证患者血清无上调mRNAs作用；血瘀证患者血清促进细胞表皮生长因子受体(EGFR)、PI3K、Akt、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)和 NF-κB等蛋白表达水平增高，与各对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，脾气虚证患者血清无促进此五蛋白表达作用。结论噎膈血瘀证患者血清能够促进细胞增殖，该证候的分子机制可能与PI3K/Akt/NF-κB信号通路过度激活有关；脾气虚证患者血清无刺激细胞增殖作用，其证候分子机制有待探讨。

【关键词】食管肿瘤；血瘀证；脾气虚证；血清；EC9706细胞

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81101912)；河北省自然科学基金资助项目(H2013209053)

【中图分类号】R 735.1

收稿日期：(2015-08-11；修改日期：2015-10-15)

贾永森，林清，秦丽娟，等.不同证候噎膈患者血清调控食管癌EC9706细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路差异分析[J].中国全科医学，2015，18(34)：4261-4265.[www.chinagp.net]

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Regulation of Sera From Esophageal Cancer Patients With Different Syndromes on Cell Proliferation and PI3K/Akt/NF-κB Signaling Pathway of Esophageal Carcinoma EC9706 CellsJIAYong-sen,LINQing,QINLi-juan,etal.CollegeofTraditionalChineseMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms of Blood-Stagnation Syndrome (BSS) and spleen-Qi-dificiency syndrome (SQDS) patients with Esophageal cancer (EC) through observation on cells proliferation,mRNAs and proteins expression in PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway regulated by sera from patients.MethodsFrom June to December,2014,we enrolled patients who were definitely diagnosed with esophageal squamous cell carcinoma in oncology department of Tangshan People′s Hospital and Yanshan Hospital.According to TCM Professional Standard of People′s Republic of China/ TCM diagnosis and efficacy standard,we determined the standard of blood stasis syndrome and spleen-yang deficiency syndrome in patients with dysphagia.We enrolled 10 patients of blood stasis syndrome,10 patients with spleen-yang deficiency syndrome,and another 10 healthy controls (people who received physical examination from the two hospitals).EC9706 cells were put into CO2incubator with a temperature of 37 ℃ and a saturation humidity of 5% and were cultured for 24 hours and kept hungury for 24 hours.Then serum of patients of blood stasis syndrome and spleen-yang deficiency syndrome and healthy controls was put into the incubator by proportional gradient,and MTT staining method was used to detect the changes in cell proliferation;the expression levels of PI3K,Akt and NF-κB mRNA were measured by Real-time PCR,and the protein expression of relevant molecules of PI3K/Akt/NF-κB signalling pathway was detected by Western blot method.ResultsHalf maximal (50%) promotion concentration (PC50) of BSS was 71.1 μl/ml,PC50 of SQDS was 118.0 μl/ml.Sera from BSS patients promoted PI3K,Akt and NF-κB mRNAs expression,being significantly different from those in control group (P<0.05),however,sera from SQDS patients didn′t work.Western blot assay showed that BSS patients′ sera stimulated over-expression of EGFR,PI3K,Akt,p-Akt and NF-κB,showing significant difference from control group(P<0.05),however,sera from SQDS patients didn′t work.ConclusionSera from BSS patients stimulates EC9706 cells proliferation.Molecular hypostasis of BSS relates to over-activation of PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway.Sera from SQDS patients can′t stimulate EC9706 cells proliferation,and molecular hypostasis of it needs further study.

【Key words】Esophageal neoplasms;Blood-stagnation syndrome;Spleen-qi-dificiency syndrome;Serum;EC9706 cells

噎膈是以进食时吞咽困难、哽咽不顺、饮食难下或食入即吐为主症的疾病，与现代医学食管癌的表现十分相似[1]。有研究对噎膈中医证型的分布规律进行分析，结果显示血瘀证占所有证型的50%左右[2]；同时，脾气虚证在食管癌形成和转移过程中起着至关重要的作用[3-4]，血瘀和气虚是食管癌中医病机非常重要的两个方面。近年来，中医药辨证抗癌越来越显示出独特优势，但辨证的宏观性、经验性亟待微观、客观证据的支持。本研究以健康志愿者血清为对照，观察了噎膈血瘀证、脾气虚证患者血清对食管癌EC9706细胞增殖及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子kappaB(NF-kB)信号通路关键分子mRNA和蛋白表达的影响，以期揭示噎膈血瘀证、脾气虚证血液微环境的证候分子机制。

1对象与方法

1.1研究对象临床病理确诊食管癌患者中95%以上为鳞癌。本研究于2014年6—12月选择唐山市人民医院、迁安燕山医院肿瘤内科的病理确诊食管鳞癌患者。按照《中华人民共和国中医药行业标准——中医病症诊断疗效标准》[5]确定噎膈血瘀证或脾气虚证标准，由3名独立调查员执行辨证，选取血瘀证、脾气虚证患者各10人分别为血瘀证组、脾气虚证组，另选取上述医院的健康志愿者10人为健康组。患者纳入标准：(1)符合食管鳞癌病理诊断；(2)符合噎嗝血瘀证或脾气虚证中医证候诊断；(3)年龄为55～85岁。排除标准：(1)不符合上述西医诊断标准及中医辨证标准者；(2)已接受普通药物治疗、手术治疗或放化疗者；(3)不愿接受研究措施或其他原因不能合作者。本研究通过了华北理工大学医学伦理审查委员会的批准，入选者均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器人食管癌EC9706细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)；RPMI1640培养液(GIBCO公司)；新生牛血清(BCS，GIBCO公司)；胰蛋白酶(GIBCO公司)；噻唑蓝(MTT，Amresco公司)；二甲基亚砜(DMSO，Amresco公司)；Trizol裂解液、互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成和荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(ABI Ambion公司)；引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；兔抗人表皮生长因子受体(EGFR)多克隆抗体；鼠抗人PI3K单克隆抗体；兔抗人Akt多克隆抗体；兔抗人磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)多克隆抗体；兔抗人NF-κB多克隆抗体(以上5抗体均产自CST公司)；山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G(IgG-HRP,华美生物工程公司)；山羊抗兔IgG-HRP(华美生物工程公司)；1100型单人超净工作台(FORMA公司)；NOVAPATH 450型酶标光度计(Bio-Tek公司)；JY92-IID型超声波细胞破碎仪(新芝公司)；3336型CO2培养箱(FORMA公司)；TMD-2型倒置式显微镜(NIKON公司)；3MK型低温高速离心机(SIGMA公司)；Lightcycler 480型实时定量PCR仪(ROCHE公司)；AE-6531型垂直电泳仪(ATTO公司)；GEL-DOC-2000型凝胶扫描分析系统(BIO-RAD公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养以10%BCS RPMI 1640培养液10 ml，接种EC9706细胞于Φ100 mm培养皿中，置于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)，饱和湿度的培养箱孵育。

1.3.2人血清采集及处理晨起6：00时，抽取患者和健康人空腹血10 ml，室温静置30 min，3 000 r/min 4 ℃离心15 min，离心半径为10 cm。56 ℃水浴灭活，按单个患者1.5 ml离心管分装。血清的处理采用甲醇沉淀蛋白法：1 ml人血清，加3 ml甲醇，充分混匀后4 ℃静置过夜，3 000 r/min 4 ℃离心15 min，离心半径为10 cm。取上清液，氮吹仪37 ℃水浴挥干，加1 ml含2%BCS RPMI 1640培养基复溶，一次性无菌滤器(0.22 μm)过滤除菌，各病例血清单独保存备用。

1.3.3MTT法以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔平面培养板，含10%BCS培养液使细胞贴壁24 h后，去除BCS，饥饿细胞24 h，随机选取血瘀证、脾气虚证患者和健康人血清各1例，以RPMI1640培养液配制如下梯度浓度：3.125，6.25，12.5，25，50，100 μl/ml孵育细胞；空白对照组以不含血清培养液孵育细胞作为平行对照。每组均设置3个复孔，继续培养48 h。去上清液，每孔加100 μl含有0.2 mg/ml MTT的磷酸盐缓冲液(PBS)，37 ℃继续培养4 h，去上清，加入150 μl DMSO溶解MTT，摇床上混匀15 min，酶标仪上以570 nm/630 nm测定光密度(OD)值。按照公式：肿瘤细胞生长增殖率=(实验组OD值/对照组OD值-1)×100%[6]，计算各血清对肿瘤细胞生长的增殖率，据曲线拟合方程[7]求出人血清干预的3组细胞半数增殖浓度(PC50)值。使用各组内其他9例血清样本重复进行MTT实验，分别求得PC50后取均值即为各组的PC50值。分别以3组内各样品PC50血清浓度干预各组细胞，分别提取总RNA和总蛋白，进行实时荧光定量PCR和免疫印迹(Western blot) 检测。

1.3.4实时荧光定量PCR按照Trizol试剂说明提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将RNA进行逆转录。PCR反应体系：SYBR荧光染料 12 μl，cDNA 2 μl，Rnase-free Milliq水 8 μl。反应条件：96 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s，循环40次。引物序列如下：PI3K，上游：5′-GCACCTGAATAGGCAAGTC-3′，下游：5′-TCGCACCACCTCAATAAGT-3′；Akt，上游：5′-TTTGAAGA

GCGGCCC- TGTC-3′，下游：5′-CGGTATAGCAATTGTACA

T-3′；NF-κB，上游：5′-GAGAGCCCTT- GCCTCCTTT-3′，下游：5′-CTTCCCTTTGGTCTTTCTG-3′。β-actin，上游：5′-CACTGT- GTTGGCGTACAGG-3′，下游：5′-TCATCACCATTGGCAATGA-3′。将各组内10例血清标本均进行本实验。

1.3.5蛋白提取与Western blot分析将各组细胞冰上收集，离心，裂解细胞；3 000 rpm离心20 min 4℃；取上清。Bradford法测蛋白浓度，-20 ℃保存备用。配8% SDS-PAGE(分离胶)和积层胶。灌胶、上样、电泳，转移过夜。转移结束后，加丽春红染料染色，标记标准蛋白分子量。加封闭液在摇床上，振摇1 h，阻断膜上的非特异性结合位点；抗原抗体反应；加入ECL显色液，X线摄片。将各组内10例血清标本均进行本实验，结果进行组间比较，并做统计学分析。

2结果

2.1人血清对食管癌EC9706细胞增殖的影响将6个不同梯度浓度的人血清加入RPMI1640培养液中孵育细胞，3组血清分别干预的食管癌EC9706细胞均呈增殖趋势。据细胞增殖率得到各组曲线拟合方程如下：血瘀证组Y=-0.928+0.099x+(-1.5×10-5)x2+(-3.3×10-8)x3,PC50=71.1 μl/ml；脾气虚证组Y=-1.525+0.073x+(-2.2×10-5)x2+(-3.3×10-9)x3，PC50=118.0 μl/ml；健康人组Y=0.245+0.04x,PC50=124.3 μl/ml。方程式中，Y为细胞增殖率，x为血清浓度(见图1)。在血清浓度为25～100 μl/ml时，3组间差异有统计学意义(P<0.05)；血瘀证组细胞增殖率与其他两组比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2人血清对EC9706细胞PI3K、Akt和NF-κB mRNA表达的影响Real time PCR法测定显示，噎膈血瘀证组血清干预的EC9706细胞，PI3K、Akt和NF-κB mRNA表达显著增强(见图2)，3指标相对含量与其他三组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脾气虚证组与空白对照组和健康人组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

图1　人血清对EC9706细胞增殖作用的量效关系曲线拟合图

组别例数3.125μl/ml6.25μl/ml12.5μl/ml25μl/ml50μl/ml100μl/ml血瘀证组101.79±0.845.45±1.9612.03±2.3123.14±3.97ab42.75±4.88ab51.16±4.52ab脾气虚证组101.15±0.532.81±0.997.86±2.7116.23±4.6427.80±4.0743.95±5.71健康人组100.67±0.301.87±0.633.99±1.456.35±2.1921.74±5.1138.08±4.90F值14.73238.69383.7081245.669539.475541.791P值0.1620.0740.0580.0270.0430.041

注：与脾气虚证比较，aP<0.05；与健康人比较，bP<0.05

2.3人血清对EC9706细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达的影响Western blot法分析显示，噎膈患者血清干预的食管癌EC9706细胞PI3K/Akt信号通路蛋白表达均不同程度地增强(见图3)。血瘀证组与空白对照组、健康人组比较，EGFR、PI3K、Akt、p-Akt和 NF-κB蛋白相对灰度值均显著增强，差异有统计学意义(P<0.05)；而脾气虚证组与空白对照组和健康人组之间比较，差异无统计学意义(P>,见表3)。

3讨论

中医理论认为，气血关系密切，血行脉中赖气以推动，故有“气以行血”之论。气虚则不能行血导致血瘀证，这种内在机制为血瘀的形成奠定了基础。临床资料表明，食管癌患者初期大多表现为血瘀证候，到中后期时，证候演变为脾气虚证，两证型占食管癌证候分型的半数以上[8]。因此，探讨两证型的分子机制对于认识食管癌证候演变规律具有重要意义。

注：PI3K=磷脂酰肌醇3-激酶，Akt=蛋白激酶B，NF-kB=核因子kappaB

图2人血清对EC9706细胞PI3K、Akt和NF-κB mRNA表达的影响柱形图

Figure 2Column diagram about effect of human sera on mRNAs expression of PI3K、Akt and NF-κB in EC9706 cells

Table 2Effect of human sera on mRNAs expression of PI3K、Akt and NF-κB in EC9706 cells

组别例数PI3KAktNF-κB空白对照组1.13±0.230.73±0.161.03±0.24血瘀证组102.42±0.41abc1.45±0.39abc2.10±0.35abc脾气虚证组101.05±0.140.92±0.220.92±0.13健康人组100.89±0.210.76±0.190.94±0.21F值493.349118.779621.306P值0.0280.0390.045

注：PI3K=磷脂酰肌醇3-激酶，Akt=蛋白激酶B，NF-kB=核因子kappaB；空白对照，无血清；血瘀型噎膈患者血清浓度=71.1 μl/ml；脾气虚型噎膈患者血清浓度=118.0 μl/ml；健康人血清浓度=124.3 μl/ml。与空白对照比较，aP<0.05；与脾气虚证比较，bP<0.05；与健康人比较，cP<0.05

注：EGFR=生长因子受体，p-Akt=磷酸化-蛋白激酶B，β-actin=β-肌动蛋；A为空白对照，无血清；B为血瘀型噎膈患者血清浓度=71.1 μl/ml；C为脾气虚型噎膈患者，血清浓度=118.0 μl/ml；D为健康人血清浓度=124.3 μl/ml

图3人血清对EC9706细胞 PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响

Figure 3Effect of human sera on protein expression in PI3K/Akt signaling pathway in EC9706 cells

表3　人血清影响EC9706细胞PI3K/Akt信号通路各蛋白表达相对灰度值 ±s)

注：EGFR=生长因子受体，p-Akt=磷酸化-蛋白激酶B，β-actin=β-肌动蛋白；血瘀型噎膈患者血清浓度=71.1 μl/ml；脾气虚型噎膈患者血清浓度=118.0 μl/ml；健康人血清浓度=124.3 μl/ml；与空白对照比较，aP<0.05；与脾气虚证比较，bP<0.05；与健康人比较，cP<0.05

近年来，恶性肿瘤中医证候分子机制的研究成为热点，但不同证候肿瘤患者血液微环境差异以及相关分子机制的报道甚少。人体内外各种因素引起血液环境改变，而血液又反作用于肿瘤细胞[9]。如同其他恶性肿瘤一样，不同证候食管癌的发生与患者血液微环境的改变关系密切。本研究着眼于不同噎膈证候血液微环境差异，观察噎膈血瘀证、脾气虚证微环境对鳞癌细胞的干预作用，以探讨食管癌血瘀、气虚证候的分子机制。

MTT法检测表明，噎膈血瘀证患者血清显著刺激EC9706细胞增殖，其PC50值为71.1 μl/ml培养液体积；而脾气虚证患者PC50为118.0 μl/ml。在血清浓度为25~100 μl/ml时，血瘀证组细胞增殖率均明显高于脾气虚组细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，表明血瘀证噎膈患者血清显著刺激细胞增殖，而脾气虚证患者血清对癌细胞的促增殖作用较小。本研究采用PC50浓度值作为衡量证候血清刺激细胞增殖差异的指标，主要基于细胞毒药物抑制细胞实验。众所周知，PC50值被业界广泛应用于抗癌药物抑制肿瘤细胞的研究，已经成为相关研究的金指标之一。本实验观察了不同证候患者血清影响食管癌EC9706细胞的分子机制，为了更科学、准确地反映证候血清的作用差异，不同组别细胞增殖程度须保持一致，这是比较证候间分子机制差异的重要前提。因此，选择PC50浓度的证候血清保证了组间比较时干预因素的同一性和可比性。

PI3K/Akt/NF-κB信号通路与癌症的发生发展、转移关系密切；食管癌多种肿瘤都可以激活此通路[10]。以EGFR为代表的生长因子受体激活PI3K产生第二信使。Akt是PI3K下游仅有的可促进细胞进行恶性转化的蛋白，Akt的磷酸化(p-Akt)进一步激活NF-κB[11]。NF-κB是多种生理和病理过程的关键转录因子，它的一个特定功能是通过诱导靶基因来促进细胞存活，其产物可抑制正常细胞和癌细胞的细胞凋亡[12]。NF-κB的活性被激活后，可启动下游分子如TNF-α、IL-1β等，从而促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移。

本实验运用实时荧光定量PCR和Western blot法检测了空白对照组、噎膈血瘀证患者血清组、脾气虚证组和健康人组中PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关因子表达。实时荧光定量PCR检测显示，噎膈血瘀证血清干预的EC9706细胞，PI3K、Akt和NF-κB mRNA表达显著增强，与其他三组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而脾气虚证患者血清干预的细胞3指标无增高，与空白对照和健康人血清干预作用比较无统计学意义。表明噎膈血瘀证候微环境在RNA水平上调了相关因子的转录水平。Western blot结果显示噎膈血瘀证患者血清干预的细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路EGFR、PI3K、Akt、p-Akt和 NF-κB蛋白表达均显著增强，与空白对照组、健康人组血清组干预细胞的蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，显示出了证候血清的多靶点刺激效应。而脾气虚证患者血清干预的细胞5个指标无增高，与空白对照和健康人血清干预作用比较无统计学意义。表明噎膈血瘀证患者的血清对PI3K/Akt/NF-κB信号通路各蛋白具有特征性促表达作用，而以脾气虚证为代表的噎膈患者血清对食管癌细胞的PI3K/Akt/NF-κB信号通路刺激作用较弱。因此，本研究组提出噎膈血瘀证“PI3K-NF-κB证候分子标志物”的概念，即噎膈患者体内PI3K/Akt/NF-κB信号通路的过表达与血瘀证候密切相关。

本实验从细胞增殖、PI3K/Akt/NF-κB信号通路mRNAs和蛋白表达等角度研究了不同证候噎膈患者血清对食管癌EC9706细胞的干预作用和分子机制。需要指出的是，噎膈不同证候的形成是很复杂的，其他相关和更深层次的机制值得深入研究。

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(本文编辑：石变华)