复合微生物固态发酵整粒棉籽的研究

■ 刘倚帆 王星凌 岳寿松 钱 鑫 万发春 赵红波 刘晓牧

（1.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100；3.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东济南 250100；4.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018）

我国是全球棉花产量最高的国家，棉籽产量已超过了1 000万吨，棉籽脱壳后棉仁中含油脂30%～33%，含蛋白质35%～38%，是优良的植物油脂资源，也是重要的植物蛋白资源。此外，棉籽中还富含高附加值的棉籽糖、维生素E、木糖醇等，是重要的饲料资源[1]。全棉籽的粗蛋白质含量较稳定，平均22.5%～24.9%；粗脂肪含量16.9%～24.7%，而中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量很高，分别为39%～52%和29%～40.1%[2]。目前，对整粒棉籽在牛生产性能上的研究主要集中在奶牛上，育肥肉牛上很少报道。朱文涛等（2008）[3]研究表明，奶牛日粮中添加8%全棉籽使产奶量提高5.65%；钟荣珍等研究表明，饲粮中添加全棉籽可以提高奶牛产奶量，改善乳脂品质[4]。本团队在前期利用整粒棉籽进行了一系列研究，在一定范围内用全棉籽替代精料中的棉饼和油脂能提高育肥阉牛的生长速度[5]。限制棉籽应用的因素包括其自身含有的有毒、有害物质如棉酚、硫代葡萄糖苷，以及纤维素、低聚糖等抗营养因子，而且蛋白质品质较差，蛋氨酸等必需氨基酸含量低且不平衡等，目前通过微生物发酵方法以脱毒及提高饲用品质的报道都是针对棉籽粕，但对整粒棉籽发酵尚未见报道。因此，本试验旨在研究整粒棉籽经微生物有氧发酵后营养成分、pH值、氨基酸含量及黄曲霉毒素的变化，观察和评估棉籽的发酵效果和营养价值，从而为棉籽在反刍动物饲料中的应用提供有效的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉籽：市售。米曲霉、马克思克鲁维酵母菌均由岳寿松博士实验室提供。

1.2 试验设计

棉籽发酵为有氧发酵，采用固态发酵的方式，米曲霉和酵母菌分别以0.8%和0.2%的接种量接种于7 kg棉籽中，水分含量为30%，发酵温度为30℃，在第7、14 d取样，一份65℃烘干测定初水分，用于常规饲料成分检测；一份-20℃保存用于鲜样测定。具体试验设计见表1。

表1 棉籽发酵试验设计

1.3 试验方法

1.3.1 棉籽形态、气味观察及霉变比例的测定

每次取样前先观察记录棉籽的形态及挥发出的气味，并测定霉变比例。

1.3.2 pH值测定

在规定取样时间，选取对照组和发酵组样品各10 g，加蒸馏水90 ml，于摇床上100 r/min振荡30 min，使用pH计测定其pH值。

1.3.3 常规营养成分测定

干物质（DM）：采用失重法测定；

粗蛋白质（CP）：采用凯氏定氮法测定;

粗脂肪（EE）：采用残余法测定；

有机物（OM）：采用灰化法测定；

能量（GE）：采用氧弹热量计法测定；

Ca、P：采用原子吸收光谱法测定；

酸性洗涤纤维（ADF）：采用NY/T 1459—2007测定；

中性洗涤纤维（NDF）：采用GB/T 20806—2006测定。

1.3.4 氨基酸组成的测定

参考GB/T 18246—2000，采用氨基酸自动分析仪测定。

1.3.5 黄曲霉毒素的测定

参考GB/T 5009.23—2006，采用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1。

2 试验结果

2.1 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽霉变比例的影响（见表2）

表2 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽霉变比例的影响（W，%）

由表2可知，与对照组相比，米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵能有效降低整粒棉籽在发酵过程中的霉变产生，在发酵第7 d和第14 d发酵组比对照组分别降低了60%和50%，差异极显著（P＜0.01）。

2.2 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽pH值的影响(见表3)

表3 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽pH值的影响

由表3可知，发酵后7 d与发酵前的pH值没有显著差异，但发酵后14 d发酵组pH值升高。同时，与对照组相比，发酵组在第7 d与对照组差异不显著，发酵后14 d pH值极显著升高（P＜0.01）。

2.3 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽营养成分的影响（见表4）

表4 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽营养成分的影响

由表4可知，米曲霉加酵母菌混合固态有氧发酵整粒棉籽第7 d，营养成分如粗蛋白、粗脂肪含量以及能量均高于对照组，比对照组分别提高6.2%、5.6%和25.6%，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维低于对照组。同时，与发酵前相比，发酵后棉籽的粗蛋白、粗脂肪的含量分别提高了12.27%、11.39%，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降低了5.5%和4.1%。而发酵第14 d，发酵组粗蛋白含量低于对照组，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维高于对照组。同时，与发酵前相比，粗蛋白、磷、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维提高，而钙含量及能量降低。

2.4 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽氨基酸组成的影响（见表5及表5续）

表5 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽氨基酸组成的影响(g/100 g)

表5(续) 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽氨基酸组成的影响(g/100 g)

由表5的试验结果可知，米曲霉加酵母菌混合固态有氧发酵整粒棉籽第7 d，发酵组必需氨基酸及总氨基酸含量比对照组分别提高了3.55%和8.14%，且比发酵前棉籽氨基酸含量分别提高了22.9%和27.2%，其中必需氨基酸中的蛋氨酸含量比发酵前提高了59%。但到发酵第14 d，必需氨基酸及总氨基酸含量均低于对照组，且比发酵前氨基酸含量明显降低。

2.5 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽黄曲霉毒素B1的影响（见表6）

表6 米曲霉、酵母菌混合固态有氧发酵对整粒棉籽黄曲霉毒素B1的影响(μg/kg)

由表6可知，发酵前并未检测出棉籽中含有黄曲霉毒素B1，在发酵第7 d，对照组黄曲霉毒素B1含量高达340 μg/kg，发酵组未检出。发酵第14 d，对照组黄曲霉毒素B1含量高达354 μg/kg，发酵组未检出。

3 讨论

棉籽脂肪含量18.09%，与大豆脂肪含量相似，比豆粕含量高，其中，不饱和脂肪酸占70%，是反刍动物优良的能量饲料来源。粗蛋白质含量达30.57%，在常规原料中仅次于大豆类原料。王平等（2003）[6]研究日粮不同棉籽水平对肉牛消化率的影响的结果表明，添加棉籽后对日粮ADF消化率有显著促进作用，且添加25%棉籽组日粮养分消化率要低于添加13%棉籽组，日粮中粗脂肪消化率明显提高。但是，棉籽自身含有抗营养因子如纤维素、低聚糖等，而且蛋白质品质较差，必需氨基酸不平衡等因素又导致棉籽在实际生产应用中受到诸多限制。本试验探讨利用微生物发酵棉籽的适宜的生产模式，以期改善棉籽品质，提高其营养价值，为进一步开发棉籽的应用潜力提供理论依据。

菌种是微生物发酵取得良好效果的关键，原料经发酵后气味芳香、适口性好，发酵过程中可产生多种水解酶，富含B族维生素等；黑曲霉、米曲霉、根霉、木霉等霉菌可以分泌丰富的酶类，如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等，这些酶能够促进原料中的淀粉、纤维素等高分子化合物分解为单糖，供微生物生长需要；且菌体中蛋白质含量也较高，达到20%～30%，因此，在蛋白质饲料的生产中这些种类的霉菌得到广泛应用。夏新成等（2010）[7]利用两株酵母和一株霉菌对棉籽粕进行复合发酵，使底物粗蛋白提高了17.72%。张庆华等（2007）[8]采用热带假丝酵母、拟内孢霉菌和植物乳杆菌三株菌协同固态发酵棉籽粕，发酵后蛋白质和氨基酸含量显著提高。吴伟伟（2009）[9]研究了黑曲霉与酿酒酵母混合固态发酵对棉籽饼粕的脱毒效果及提高棉籽饼粕营养价值的作用，结果表明，发酵温度30℃、接种量15%，发酵时间为60 h，使真蛋白含量从32.99%提高到42.40%，必需氨基酸中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸分别较发酵前相比增加了31.03%、25.00%和22.23%，而且17种氨基酸的总量较发酵前相比增加了30.10%。张文举等（2006）[10]利用热带假丝酵母与黑曲霉复合固体发酵使棉籽饼底物粗蛋白、总氨基酸、必需氨基酸含量分别提高了27.83%、18.15%、19.18%。研究表明，发酵处理后底物粗蛋白质含量提高的原因：一是，由于微生物大量生长繁殖，而微生物菌体蛋白丰富，从而增加了粗蛋白质的含量；二是，微生物通过对基质利用，可大量合成自身所需要的菌体蛋白和细胞骨架，将其转化成菌体蛋白或分泌蛋白，从而提高了饲料中的蛋白质含量。另外，在发酵过程中同时也消耗一定量的糖类物质，释放出能量和二氧化碳，糖类物质比例降低后从而也导致基质中蛋白质的单位含量的增加。棉籽是重要的植物性蛋白质和能量资源，但由于其中的蛋白质相对分子量较大，结构紧密，不利于动物的消化和吸收，通过微生物发酵的方法，可将其中的大分子蛋白降解为小分子蛋白及多肽，从而提高动物对其消化利用率。本试验利用米曲霉和酵母菌混合固态有氧发酵，添加量1%，含水量30%，发酵温度30℃，发酵第7 d，肉眼可见棉籽上覆盖一层黄色的米曲霉孢子菌丝，且发酵组比对照组霉变比例显著下降，说明米曲霉具有防止霉变的作用。发酵后的棉籽营养成分如粗蛋白、粗脂肪含量均高于对照组，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维低于对照组，能量高于对照组。同时，与发酵前相比，发酵后棉籽的粗蛋白质、粗脂肪、磷的含量均明显提高，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维明显降低，能量明显提高，表明微生物发酵对棉籽的营养价值改善产生了显著作用，特别是发酵7 d必需氨基酸和总氨基酸含量比发酵组和发酵前棉籽均有所提高，其中蛋氨酸含量提高了59%，这可能是由于微生物发酵后微生物菌体蛋白中蛋氨酸含量较高，所以使发酵后棉籽的蛋氨酸含量也显著提高。随着发酵时间的延长和底物的消耗，在发酵第14 d，虽然发酵组粗脂肪含量仍高于对照组，但粗蛋白含量低于对照组，且中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量升高，尤其是必需氨基酸及总氨基酸含量均低于对照组，且比发酵前氨基酸含量明显降低，说明米曲霉和酵母菌混合固态有氧发酵整粒棉籽的最佳时间在7 d左右。

pH值是发酵工艺中的一个重要因素，不同的微生物都有一个适宜其生长和发挥活性功能的最适pH值范围。一般情况下，真菌生长的pH值范围为3.5～6.0，酵母菌为4.5～7.0[9]。本试验在发酵第一周（7 d内），对照组和发酵组pH值均在正常范围内，而到发酵第二周结束（第14 d），对照组pH值为7.54，发酵组pH值为8.52，高于米曲霉和酵母菌最适生长pH值范围，这也可能是导致发酵后期霉菌大量繁殖的原因。

饲料中的霉菌毒素不仅会对畜禽健康和生产性能构成危害，还会带来食品安全问题。齐鸣等(2015)[11]对饲料中常见霉菌毒素进行调查中指出，棉籽粕黄曲霉毒素B1含量较高，最高污染水平达3 992.5 μg/kg。本试验在发酵第7 d、第14 d于对照组棉籽样品中均检测出黄曲霉毒素B1，且含量分别为340、354 μg/kg，而添加米曲霉及酵母菌的发酵组并未检出黄曲霉毒素B1。因为发酵是在开放的环境下进行，参与发酵的微生物种类较多，易被杂菌污染从而产生黄曲霉毒素。本试验利用米曲霉加酵母菌混合发酵，严格控制了黄曲霉毒素的产生，是一种安全、可靠的生物控制方法。

4 结论

①米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒棉籽，能够提高植物蛋白饲料中粗蛋白、粗脂肪等营养物质的含量，并提高必需氨基酸及总氨基酸含量，从而改善饲料品质，提高了营养价值。

②米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒棉籽，能有效降低发酵过程中植物蛋白饲料的霉变比例，并且米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒棉籽能显著降解黄曲霉毒素B1。

③米曲霉和酵母菌复合固态有氧发酵整粒棉籽的最佳时间为7 d，接种量为1%，含水量30%，发酵温度30℃。