饲料中不同纳米锌含量对半滑舌鳎肝胰脏、肠道消化酶的影响

■石 慧 邢克智 王庆奎 陈成勋 郭永军 孙学亮 石洪玥

（天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384）

锌是鱼体中所必需的微量元素之一，也是目前确认的15种微量元素中生理功能最多的一种微量元素，包括参与核酸和蛋白质的合成、能量代谢、氧化还原等生化代谢过程；对生物膜的功能和结构起关键作用；能抑制脂肪过氧化或硫醇氧化；对维持动物中枢免疫器官和外周免疫器官的结构和功能起重要作用。锌分布于机体所有组织、器官和体液中[1]。

锌是机体内40多种酶的组成成分，也是200多种酶的激活分子，具有分解、合成、稳定蛋白酶的4级结构，并调整酶活性等多种生化作用[2]。同时锌作为胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶活性所必需辅助因子,参与机体蛋白质、碳水化合物和脂肪等物质的代谢[3]，直接影响消化酶的活性[4]。这些消化酶的活性直接影响对动物营养物质的吸收利用程度，进而影响动物生长发育状况[5]。研究消化酶活性对了解半滑舌鳎消化蛋白质、碳水化合物和脂肪等营养物质的吸收利用，并为合理搭配饲料原料起积极作用[6-7]。

自20世纪70年代开始研究锌对水产动物的影响以来,绝大部分的研究都集中在以硫酸锌为锌源确定水产动物锌需要量的研究上。然而近几年增加许多新形式，例如以乳酸锌[8]、甘氨酸锌[9]、碱式氯化锌[10]、蛋氨酸锌和硫酸锌[11]等为锌源研究对水产动物的影响。但以纳米锌为锌源对半滑舌鳎消化酶影响的研究报道较少。

纳米材料是指特征尺寸在纳米数量级（通常指1～100 nm）的极细颗粒组成的固体材料[12]。在这种尺度上，纳米物质会出现部分与常规尺度物质差别很大的特殊化学物理性质[13]。物质被纳米化后其吸收、毒性和排泄方式都有所改变。纳米氧化锌具有较高的生物活性、吸收率和免疫调节功能，相对较少的纳米氧化锌既能达到促进生物体生长的功效。同时，纳米氧化锌的热稳定性较好，可与多种有机物包括病毒和细菌发生氧化反应，从而达到杀菌消毒的作用[14]。

目前，国内饲料工业、畜牧业已经研究和应用纳米技术，许多饲料原料均可利用纳米化技术进行处理，诸如某些矿物质、微量元素经过纳米化处理后,不仅能充分被动物吸收，最大限度地提高其生物利用率，并可衍生出许多新的物理性质，而对动物产生新的生物学功能[15]。王天成等[16]研究结果表明，大剂量微米锌粉与纳米锌粉对小鼠血清生化指标的影响有明显不同，纳米锌和微米锌对小鼠血清生化指标具有不同影响的机制，目前尚不清楚，这可能与纳米锌材料的特殊理化性质有关。

本试验所用纳米锌直径为20 nm，将其以不同含量添加到基础饲料中，研究纳米锌对半滑舌鳎肝脏及肠道消化酶（蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶）的影响，为纳米锌在半滑舌鳎人工配合饲料中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用同一批次、健康的半滑舌鳎（52.68±0.13）g作为试验用鱼，试验鱼取自天津市海发珍品实业发展有限公司。试验用纳米锌由南京先丰纳米材料科技有限公司生产。

1.2 试验方法

试验开始前将试验鱼驯化14 d，驯化期间喂食不添加纳米锌的基础饲料(见表1)。在基础饲料中分别添加0、30、60、90、120、180 mg/kg纳米锌（基础饲料中Zn含量为53.16 mg/kg）制成6种饲料，另加一组以无机锌（ZnSO4·7H2O含锌量为52.29 mg/kg)为锌源饲料用于进行对比，共7种饲料。每个水平设3个重复，每个重复35尾试验鱼，共735尾。基础饲料所用的秘鲁鱼粉、豆粕、虾粉、酵母等原料均粉碎过60目筛，微量元素采用逐级扩大法添加，均匀的混入基础饲料中，混合均匀后用饲料机制成粒径为2 mm的颗粒状饵料，阴干后置于-20℃冰柜中保存备用。连续喂食84 d后取样，测定肝胰脏、肠道消化酶指标。

1.3 试验管理

试验采用流动循环海水进行养殖，养殖系统由21个直径为1 m的鱼箱组成。试验鱼先在养殖系统中驯化14 d，驯养阶段喂食基础饲料。每日投喂2次（8：00、16：00），投喂量占鱼体重量的1%左右。每天观察试验鱼状况，记录死鱼数目与摄食情况，依据摄食情况及时调节饲料投喂量。每天监测水质指标（水温、盐度、溶氧、pH值、硝态氮、氨态氮），见表2。

表1 试验基础饲料配比

表2 水质指标

1.4 样品采集

连续喂食84 d后，试验鱼停止投喂24 h后称重取样，每箱随机取9尾鱼，用MS-222麻醉后测量体长、体重。用无菌注射器从尾柄动/静脉采血，其中一部分用肝素钠（50 U/ml）抗凝，用于血液指标的测定；另一部分不抗凝，室温静置4 h后，离心（4℃、3 500 r/min、10 min），收集血清，-80℃冷冻保存，用于血清生理生化指标的测定。将其中的6尾用75%的乙醇棉球擦干鱼体，冰盘上取肝胰脏及肠道（前、中、后）用于消化酶指标的测定。

2 消化酶活力指标测定

2.1 消化酶活力测定

2.1.1 粗酶液的制备

将取血后的试验鱼置于冰盘内，解剖后取出肝胰脏及肠道（分为前肠、中肠、后肠），用预冷的生理盐水漂洗，然后将组织中的内容物及结缔组织除去，滤纸拭干后将组织剪碎，移入组织研磨器中，加入4倍样品重量的预冷生理盐水，匀浆后离心（4℃、4 000 r/min，15 min），取上清液，即酶粗提液。酶粗提液应4℃保存，24 h内测定完毕。

2.1.2 蛋白酶活力测定

用福林酚法测定。

蛋白酶活力定义：以37℃每毫克组织蛋白每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个活力单位。

蛋白酶活力单位(U/mg prot)=A/15×F/匀浆液蛋白含量，其中A为样品测得光密度查曲线所得相应酪氨酸含量(μg)；F为酶液最终稀释倍数；15为反应时间(min)。

2.1.3 脂肪酶活力测定

用甘油三酯法，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

脂肪酶活力定义：在30℃条件下，每克组织蛋白在本反应系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位。

2.1.4 淀粉酶活力测定

用碘淀粉显色法，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

淀粉酶活力定义（U/mg prot）：在pH值7.0的条件下，以30 min内每毫克组织蛋白中的淀粉酶在37℃下能完全水解10 mg淀粉为一个酶活力单位。

2.2 蛋白定量指标测定

用考马斯亮蓝法，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定

2.3 数据分析

试验所得数据均采用“平均值±标准误”表示，用SPSS软件对数据进行统计学分析，先将数据进行单因素方差分析（ANOVA），差异显著（P＜0.05）的用Duncan's法做多重比较。

3 结果

3.1 纳米锌对半滑舌鳎肝胰脏、肠道蛋白酶活力的影响(见表3)

表3 饲喂纳米锌84 d后对半滑舌鳎肝胰脏、肠道蛋白酶活力的影响（U/mg prot）

由表3可看出，添加纳米锌对半滑舌鳎肝胰脏、前肠的蛋白酶活力影响均呈先上升后下降的趋势。

当纳米锌的添加量为90 mg/kg时，肝胰脏的蛋白酶活力达到最高值，且显著高于其他各组(P＜0.05)。

当纳米锌的添加量为60 mg/kg时，前肠的蛋白酶活力达到最高值，且蛋白酶活力显著高于除90、120 mg/kg外其他各组，随着纳米锌添加量的加大，蛋白酶的活力逐渐降低。

中肠的蛋白酶活力在无机锌组呈现最高值，而在纳米锌组添加量为90 mg/kg时呈现最高值，较于无机锌组无显著差异(P＞0.05)，且显著高于除60 mg/kg组以外其他各组(P＜0.05)，同样随着纳米锌添加量的加大，蛋白酶活力逐渐降低。

后肠的最高值出现在60 mg/kg组，且显著高于对照组及30 mg/kg组。添加纳米锌对蛋白酶活力的影响也呈先上升后下降的趋势。

3.2 纳米锌对半滑舌鳎肝胰脏、肠道脂肪酶活力的影响(见表4)

表4 饲喂纳米锌84 d后对半滑舌鳎肝胰脏、肠道脂肪酶活力的影响（U/mg prot）

由表4可知，添加纳米锌对半滑舌鳎肝胰脏、肠道的脂肪酶活力影响均呈先下降后上升的趋势。各组的最高值均出现在对照组，且都显著高于无机锌组(P＜0.05)。

当纳米锌的添加量为60 mg/kg时，肝胰脏、中肠、后肠的脂肪酶活力均呈现最低值，且肝胰脏、前肠和后肠的脂肪酶活力显著低于对照组(P＜0.05)。

当纳米锌的添加量为90 mg/kg时，前肠的脂肪酶活力最低，且显著低于对照组(P＜0.05)，较于无机锌组均无显著差异(P＞0.05)。

3.3 纳米锌对半滑舌鳎肝胰脏、肠道淀粉酶活力的影响(见表5)

表5 饲喂纳米锌84 d后对半滑舌鳎肝胰脏、肠道淀粉酶活力的影响（U/mg prot）

由表5可知，添加纳米锌对半滑舌鳎肝胰脏及前肠的影响均为先上升后下降的趋势。

当纳米锌的添加量为120 mg/kg时，肝胰脏、前肠的淀粉酶活力均呈现最高值，肝胰脏的蛋白酶活力显著高于除添加量为90 mg/kg以外其他各组(P＜0.05)。前肠蛋白酶活力显著高于除添加量180 mg/kg以外其他各组(P＜0.05)。

添加纳米锌对半滑舌鳎中肠的影响随着纳米锌添加量的增加，淀粉酶的活力也随之增加，但中肠的淀粉酶活力最高值出现在无机锌组，且显著高于添加纳米锌各组(P＜0.05)。

当纳米锌的添加量为30 mg/kg时，半滑舌鳎后肠淀粉酶的活力呈现最高值。除显著高于添加纳米锌90 mg/kg外(P＜0.05)，较其他各组无显著差异(P＞0.05)。

4 讨论

4.1 锌对水产动物蛋白酶活力的影响

鱼类消化酶活性的高低直接关系到鱼类对营养物质的吸收和利用[17]，其酶活性的增强可提高营养物质的消化率[18]。

蛋白酶是生物体内的一类酵素(酶)，它们是分解蛋白质的有效物质。不同鱼类蛋白酶的分泌部位及形式也有所不同。Jany[19]发现银鲫(Carassius auratus)肝胰脏蛋白酶的活性很弱，但经肠液激活后，其酶活性明显升高，且高于肠蛋白酶，因此银鲫肠道被认为是致活酶的主要分泌场所。而倪寿文[20]的研究表明，鲤鱼、草鱼肝胰脏蛋白酶的活性明显高于肠道，而鲢鱼、鳙鱼肝胰脏蛋白酶的活性则小于肠道。本试验结果表明肝胰脏的蛋白酶活性都最大，这与田相利等[21]的研究结果相一致，其次为后肠、前肠，无论添加的锌源为无机锌还是纳米锌，中肠的蛋白酶活力都最低。然而锌离子对水产动物作用的研究结果不尽相同，Vega-Villasante等[22-23]对加州美对虾(Farfantepenaeus californiensis)消化酶的研究表明,在1×10-2mol/l浓度下Zn2+对蛋白酶活性有抑制作用；王海英等[24]研究在5×10-3mol/l浓度下,Zn2+对大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)肠道蛋白酶活性有抑制作用。但王吉桥等[25]在研究金属离子对仿刺参蛋白酶活性影响时表明,Zn2+对其有轻微的激活作用,相对酶活性为108.8%；王敏奇等[26]等在断奶仔猪饲粮中添加3 000 mg/kg的氧化锌,十二指肠内容物总蛋白酶、胰蛋白酶的活性分别较对照组提高6.29%、25.37%。而在本试验中当纳米锌的添加量为90 mg/kg时，半滑舌鳎肝脏蛋白酶显著高于其他各组（P＜0.05)，且显著高于无机锌组。随着纳米锌添加量的继续加大，蛋白酶活力逐渐降低，这说明适当的纳米锌添加量能提高半滑舌鳎肝脏蛋白酶活力，但添加量过大会对肝脏蛋白酶活力产生不利影响。

4.2 锌对水产动物脂肪酶活力的影响

脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够使脂肪水解，为动物体生长以及繁殖提供能量和必需的脂肪酸[27]。有研究结果显示，草鱼和鲤鱼的肝胰脏脂肪酶活性明显高于肠道；鲢鱼和鳙鱼肝胰脏脂肪酶活力明显低于肠道；尼罗非鲫的肝胰脏脂肪酶活力与肠道几乎相等，而胃脂肪酶活性却明显低于肝胰脏和肠道[28]。本研究结果显示，除纳米锌添加量90 mg/kg组外，其他各组半滑舌鳎脂肪酶活性在前肠呈现最高值，其次是肝胰脏，在后肠呈现最低值。而锌离子对水产动物脂肪酶影响的研究可参考的资料不多，付新华[29]研究表明，Zn2+对大菱鲆脂肪酶具有抑制作用。这与本试验研究结果一致，无论锌源为无机锌还是纳米锌，半滑舌鳎肝胰脏和肠道脂肪酶的活性都有所降低。

4.3 锌对水产动物淀粉酶活力的影响

淀粉酶活性的高低直接影响到鱼类对食物中碳水化合物的消化能力。关于肠道淀粉酶的分布，不同研究有不同的结果：黑鲈、鲤鱼、铜吻鳞鳃太阳鱼、黄颡鱼[30]、草鱼[31]等淀粉酶在后肠活性最强而前肠最弱。而本试验结果显示当纳米锌添加量为0、30、60 mg/kg时后肠淀粉酶活力均大于中肠及前肠，当添加量增到90、120、180 mg/kg时中肠的淀粉酶活力最高，说明高剂量的纳米锌提高了淀粉酶的活力。而辛碧芬等[32]研究金属离子对鲢鱼肝胰脏淀粉酶活性的影响得出2价金属离子对酶活力具有抑制作用。Vega-Villasante等[22-23]对加州美对虾Farfantepenaeus californiensis消化酶的研究表明,在1×10-2mol/l浓度下,Zn2+对淀粉酶活性有明显抑制作用；胡毅[33]研究三疣梭子蟹中肠淀粉酶活性的结果显示，低浓度的Zn2+对淀粉酶有激活作用,高浓度则表现为抑制作用。而本试验研究结果显示，当纳米锌的添加量为120 mg/kg时肝胰脏、前肠、后肠淀粉酶的活力最大，随着纳米锌添加量的继续增大淀粉酶的活性呈现降低趋势；而对半滑舌鳎中肠淀粉酶的影响来说，虽然随着添加量的增加淀粉酶活性也随之增加，但是影响不显著，而添加无机锌组淀粉酶活力显著高于纳米锌组。